PEI promueve la fijación de células de débil anclaje y tejidos primarios
Las células PC-12 se utilizan como modelo de diferenciación neuronal en el laboratorio, ya que el tratamiento de estas células con factor de crecimiento nervioso (NGF) induce la extensión de neuritas y la expresión de marcadores bioquímicos del fenotipo neuronal simpático . Crecen como células de anclaje débil y los polímeros de colágeno o de polilisina se utilizan con frecuencia para precubrir las placas de cultivo de células PC-12 . Las células PC-12 se cultivaron en el laboratorio en pocillos sin recubrimiento o en pocillos pre-recubiertos con diversos factores de fijación (placas de cultivo tisular multipocillos-12), para observar el efecto sobre el anclaje de las células al sustrato. En ausencia de cualquier agente de recubrimiento, las células mostraron una tendencia característica a formar grupos de células que se acumulan hacia el centro del pozo; estas células están firmemente adheridas entre sí, pero muy débilmente adheridas a la placa de cultivo de tejidos (Figura 1D). Esto da lugar a una distribución muy heterogénea de las células (quedan muy pocas células hacia el borde de los pocillos) y a una pérdida significativa de células durante los procedimientos de lavado o los cambios de medio. El pretratamiento de las placas con PEI dio como resultado una distribución significativamente más homogénea de las células en el pozo, con células que se adhieren firmemente a la placa, mostrando una tendencia mucho menor a la agrupación (Figura 1A). A modo de comparación, las placas también fueron pretratadas con otros agentes de recubrimiento comúnmente utilizados, colágeno (Figura 1B) y poli-D-lisina (PDL; Figura 1C), resultando también en una fijación más firme de las células a las placas y una distribución más homogénea de las mismas.
Adhesión de células PC-12 y explantes neuronales a placas de cultivo. Las células PC-12 se adhirieron mejor a las superficies de plástico que fueron pretratadas con factores que promueven el anclaje, como PEI (panel A), colágeno (panel B) o PDL (panel C), en comparación con el control de la superficie de plástico no tratada (panel D), que contenía células en racimos y muy poco adheridas al sustrato (las imágenes se tomaron a medio camino entre el centro y el borde de la placa). El recubrimiento con PEI dio lugar a una distribución homogénea de células firmemente adheridas al sustrato de la placa (panel A). El PEI promueve la adhesión a las placas de cultivo de los explantes de retina del pez cebra (panel E). Este factor de fijación apoyó la extensión de las neuritas en los explantes de retina preparados para el crecimiento axonal mediante una lesión de preacondicionamiento del nervio óptico (panel F). La barra en las fotomicrografías corresponde a 25 μm en los paneles A-D, 50 μm en el panel E y 100 μm en el panel F.
Para comprobar aún más la propiedad de mejora del anclaje observada con el pretratamiento con PEI de los platos de cultivo, se utilizó un segundo sistema. Los explantes de retina de peces teleósteos se han utilizado en el estudio de la regeneración nerviosa. Cuando se aplica una lesión al nervio óptico del pez, se inicia una respuesta de regeneración y las células ganglionares de la retina vuelven a extender su axón hacia el tejido tectal objetivo. Si la retina de un pez «cebado» se explanta y cultiva, la respuesta de regeneración se observa in vitro mediante la extensión acelerada de largas neuritas. Sin embargo, este fenómeno requiere el uso de matriz extracelular o factores de fijación (por ejemplo, colágeno o recubrimiento de PDL), ya que los explantes muestran muy poca afinidad por la superficie de plástico sin recubrimiento. Se llevaron a cabo experimentos para observar si la PEI podía actuar como factor de fijación que propiciara el crecimiento axonal a partir de explantes de retina de pez cebra. Los explantes de retina de los ojos del pez cebra de control fueron capaces de adherirse a las placas de cultivo tratadas con PEI (Figura 1E). Además, los explantes de retina de peces que recibieron una lesión condicionante fueron capaces de extender axones vigorosamente cuando se cultivaron utilizando PEI como factor de fijación (Figura 1F).
Los resultados con los explantes de retina sugirieron que las células neuronales adheridas a los platos recubiertos de PEI pueden diferenciarse, generando neuritas que se adhieren bien al sustrato. Para comprobar esta hipótesis con las células pro-neuronales PC-12, se realizaron experimentos de diferenciación mediante el tratamiento con NGF con células adheridas a platos recubiertos con PEI. Las células PC-12 tratadas con NGF permanecieron firmemente adheridas al plato durante varios días, generando redes de neuritas (Figura 2). Los resultados indican que el PEI es permisivo para el proceso de diferenciación y para la fijación de las neuritas al plato. Las células diferenciadas permanecieron firmemente ancladas a lo largo de los experimentos de inmunocitoquímica (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García y R. P. Ballestero, resultados no publicados).
Diferenciación de células PC-12 adheridas a placas de cultivo recubiertas con PEI. Las células PC-12 adheridas a las placas recubiertas de PEI permanecieron firmemente ancladas a la placa y extendieron neuritas tras el tratamiento con NGF. Las imágenes muestran el progreso de la diferenciación de las células tratadas a lo largo del tiempo: 0 h (panel A), 24 h (panel B), 48 h (panel C) y 96 h (panel D) tras el inicio del tratamiento con 100 ng/ml de NGF. La barra de las fotomicrografías corresponde a 25 μm.
Fuerza de anclaje de las células eucariotas a las placas de cultivo pretratadas con PEI y otros factores de fijación
Se seleccionaron tres líneas celulares diferentes para comprobar la capacidad del PEI de promover un fuerte anclaje a las placas de cultivo de plástico. Las células PC-12 y HEK-293 se han descrito anteriormente como de anclaje débil. Por otro lado, las células MYS son fibroblastos primarios que se adhieren fuertemente a las placas de cultivo de plástico, creciendo hasta formar una monocapa de células en la superficie. Para comprobar la fuerza de anclaje de las células diversas a las placas, se llevó a cabo un protocolo en el que se realizaron 4 lavados consecutivos con tampón isotónico, seguidos del uso de un protocolo colorimétrico para contar las células que permanecían en la placa (basado en el colorante vital rojo neutro). Las placas pretratadas con los diversos factores de fijación se compararon con las placas que no recibieron ningún pretratamiento (sin tratar). Los experimentos se realizaron por triplicado y se calcularon las medias de tinte retenido en las placas que recibieron cada tratamiento. Dichas medias se normalizaron con respecto a la media obtenida con el pretratamiento con PEI, a la que se asignó el valor arbitrario de 100,0% en todos los experimentos. Los resultados de los experimentos representativos con las 3 líneas celulares se muestran en la Figura 3 (se realizaron al menos tres experimentos independientes con cada línea celular). Las células PC-12 se adhirieron casi por igual a las placas recubiertas con PEI, colágeno o PDL (recuentos celulares relativos del 100,0% ± 5,3%, 89,3% ± 5,0% y 96,3% ± 5,8%, para PEI, colágeno y PDL respectivamente). Sin embargo, se observó una pérdida significativa de células al comparar las placas no tratadas con las placas tratadas con PEI, con un recuento celular relativo del 43,9% ± 5,8% (Figura 3A). En el caso de HEK-293, las células se adhirieron fuertemente tanto a los pozos tratados con PEI como a los tratados con PDL. En el experimento representativo mostrado en la Figura 3B, los recuentos relativos con esos dos tratamientos fueron del 100,0% ± 0,4% y del 96,8% ± 1,7% respectivamente. Sin embargo, se perdió un gran número de células cuando se chapó en los pocillos no tratados (recuento relativo del 8,3% ± 0,6%), o en los pocillos pretratados con colágeno (11,5% ± 1,2%), lo que sugiere que estas células se adhieren con bastante soltura al plástico o a los pocillos recubiertos de colágeno. Por último, cuando se utilizaron las células de fibroblastos (células MYS), las células parecían adherirse bastante bien a las cuatro superficies, incluso a los pocillos no tratados (Figura 3C). La Figura 3C muestra un gráfico representativo, en el que aparecen recuentos relativos de células MYS del 100,0% ± 2,2%, 85,9% ± 7,8%, 73,7% ± 6,6% y 77,1% ± 1,4%, con pozos pretratados con PEI, colágeno o PDL, o con pozos sin tratar, respectivamente. Por lo tanto, esta línea celular se adhiere bastante bien a la superficie de plástico no tratada en comparación con las líneas celulares PC-12 y HEK-293.
El recubrimiento de PEI promueve la adhesión firme de las células de anclaje débil al sustrato. Se midió la pérdida de células inducida por un protocolo que implicaba múltiples lavados para evaluar la firmeza en la fijación de las células a las placas de cultivo recubiertas con factores que promueven el anclaje celular. El PEI se comparó con otros factores de fijación (colágeno, PDL) y con placas de control no tratadas. Los recuentos celulares relativos se normalizaron asignando un valor arbitrario del 100,0% a las placas tratadas con PEI. El recubrimiento con PEI dio lugar a una mejora significativa de la fuerza de anclaje en las células PC-12 (gráfico A) y en las células HEK-293 (gráfico B), en comparación con otros factores de fijación utilizados habitualmente. No se observaron beneficios en la fijación de una línea celular de fuerte anclaje (células MYS, gráfico C). Las barras muestran la media ± desviación estándar de ensayos por triplicado, que son representativos de al menos tres experimentos diferentes realizados (* significativamente mayor que el control no tratado, p < 0,01; ** significativamente mayor que el control no tratado en el experimento presentado, p < 0,01, pero la significación no se mantiene en experimentos independientes).
Para proporcionar una indicación de la variación entre experimentos, se calcularon las medias ± desviaciones estándar de los recuentos celulares relativos obtenidos en los experimentos independientes para cada línea celular y tratamiento (obsérvese que, dado que en todos los experimentos el recuento de los pocillos tratados con PEI se fijó en el 100,0%, el valor de la media global con este agente de recubrimiento es exactamente el 100,0% para todas las líneas celulares). A continuación se indican los resultados comparativos de los demás tratamientos. En el caso de las células PC-12, los recuentos relativos fueron del 81,5% ± 8,8% en los pozos tratados con colágeno (n = 4), del 93,9% ± 21,2% en los pozos tratados con PDL (n = 4) y del 52,1% ± 13,7% en los pozos no tratados (n = 4). En el caso de las células HEK-293, los recuentos relativos fueron del 16,3% ± 12,7% para los pozos pretratados con colágeno (n = 3), del 99,6% ± 2,5% para los pozos pretratados con PDL (n = 3) y del 9,0% ± 4,1% para los pozos no tratados (n = 3). En los experimentos con células MYS, la media de los recuentos relativos con pozos pretratados con colágeno fue del 92,7% ± 16,2% (n = 3), del 71,1% ± 6,7% para los pozos pretratados con PDL (n = 3) y del 78,4% ± 11,5% para los pozos no tratados (n = 3). El análisis estadístico indica que la mejora de la adhesión tanto de las células PC-12 como de las HEK-293 a los platos pretratados con PEI frente al plástico no tratado es significativa (p < 0,05 y p < 0,01 respectivamente, análisis de prueba t), mientras que no es estadísticamente significativa para las células MYS (p > 0,05).
Para caracterizar aún más las propiedades del PEI como factor de fijación para las células de anclaje débil, se llevaron a cabo experimentos para analizar la dosis de PEI que puede proporcionar un anclaje celular óptimo, el rango de números de células que pueden beneficiarse de la presencia de PEI, y la estabilidad del PEI como factor de fijación. La Figura 4A muestra los resultados de un experimento representativo en el que se comprobó la fuerza de fijación de las células HEK-293 a los platos recubiertos con varias dosis de PEI. Los recuentos de células se normalizaron al valor obtenido para el tratamiento con 25 μg/ml de PEI, que se fijó en el 100,0%. Los resultados indican que las concentraciones de PEI de 2,5 μg/ml o superiores dieron lugar a una mejora máxima de la adhesión, lo que sugiere que la superficie del plato de plástico está totalmente recubierta con el polímero a estas concentraciones. Las concentraciones más altas del polímero no parecían tener efectos tóxicos en las células si el exceso de PEI que quedaba en la solución se eliminaba completamente (se observaron ligeros efectos tóxicos en la concentración de 250 μg/ml si la solución no se eliminaba completamente después del tratamiento). El experimento mostrado es representativo de 4 experimentos independientes. La figura 4B representa los resultados obtenidos con diversos números de células PC-12 y HEK-293. La figura muestra los recuentos celulares relativos, en los que se asignó un valor arbitrario del 100,0% al recuento medio obtenido de los pozos tratados con PEI con el mayor número de cada línea celular (3,2 × 105 células HEK-293 y 1,5 × 106 células PC-12). Los resultados indican que el PEI funcionó bien como factor de fijación en un amplio rango de números celulares tanto para las células PC-12 como para las HEK-293. Los números de células más bajos no pudieron probarse de forma fiable porque estaban cerca del límite de sensibilidad del ensayo de rojo neutro. Los resultados mostrados son representativos de al menos 4 experimentos independientes realizados con cada línea celular. La Figura 4C muestra los resultados de un experimento realizado para comprobar la estabilidad de la PEI como factor de fijación. En este experimento, un conjunto de placas se trató con PEI y luego se mantuvo en PBS a 4°C durante 10 días. En una segunda prueba, las placas se trataron con PEI y se mantuvieron (con medio) en la incubadora de CO2 a 37°C durante 3 días, con un cambio de medio realizado cada 24 h. El rendimiento del PEI en estas placas se comparó entonces con las placas tratadas con PEI utilizando el protocolo estándar descrito para los experimentos anteriores. Los resultados muestran los recuentos celulares relativos normalizados a la media de las absorbancias obtenidas con las placas tratadas con PEI estándar, a las que se les dio el valor arbitrario de 100,0%. Los resultados indican que el recubrimiento de PEI permanece estable en la superficie de la placa de plástico durante al menos 10 días de refrigeración, y que no se elimina por incubación a 37°C en medio o incluso por cambios repetidos de medio. Los resultados son representativos de 4 experimentos independientes realizados por triplicado.
Caracterización de las propiedades de la PEI como factor de fijación. Gráfico A: Se probaron dosis crecientes de PEI para determinar el rango de concentración para un recubrimiento óptimo. El PEI mostró una mejora total de la adhesión a partir de concentraciones de 2,5 μg/ml. Gráfico B: el PEI promovió la adhesión de las células PC-12 y HEK-293 en una amplia gama de números de células (los números probados se indican en el eje X). Gráfico C: el recubrimiento de PEI permaneció estable en la superficie de la placa de cultivo durante largos períodos de incubación y cambios de medio (10d-PBS: Placa tratada con PEI incubada durante 10 días en PBS a 4°C; 96 h-3MC: Placa tratada con PEI incubada durante 96 h con 3 cambios de medio a 37°C). En todos los gráficos, las barras muestran la media ± desviación estándar de ensayos por triplicado, que son representativos de al menos 3 experimentos independientes (* significativamente mayor que el control no tratado, p < 0,01).
El pretratamiento con PEI mejora la lipofección de células de anclaje débil
La transfección de células eucariotas por lipofección implica varios pasos, adiciones y sustituciones de medios, que pueden pasar factura a las células de anclaje débil. Aunque se tenga cuidado de evitar la pérdida de células, las células débilmente ancladas pueden ser menos eficientes en la captación de los complejos de transfección. Dado que el pretratamiento con PEI de las placas de cultivo celular aumenta la fuerza de fijación de las células a dichas superficies, se planteó la hipótesis de que el factor de fijación podría tener un efecto positivo en los rendimientos de transfección obtenidos por lipofección. Las tres líneas celulares descritas anteriormente se utilizaron para probar esta hipótesis utilizando los agentes de recubrimiento examinados anteriormente. Las transfecciones se realizaron con un plásmido que codificaba la enzima reportera β-galactosidasa. El rendimiento de la transfección se controló mediante la determinación de la actividad de la enzima reportera en los lisados de las células transfectadas. Se realizaron al menos dos ensayos independientes por triplicado con cada línea celular. En la Figura 5 se muestran gráficos representativos. Los rendimientos (actividades de β-galactosidasa) se normalizaron con respecto a la actividad obtenida con la precapa de PEI, que se fijó como referencia en el 100,0%. En general, se observó que los rendimientos de transfección mejoraron en las células de débil anclaje mediante el pre-recubrimiento con agentes que promueven la adhesión celular a la placa. En el caso de las células PC-12, el recubrimiento previo de los pocillos con PEI, colágeno o PDL dio lugar a una mejora de 2 a 3 veces del rendimiento de transfección en relación con los pocillos no tratados: rendimientos relativos del 100,0% ± 1,4% para el PEI, del 87,0% ± 8,7% para el colágeno y del 100,1% ± 2,4% para el PDL, frente al 42,9% ± 2,2% de los pocillos no tratados (Figura 5A). La mejora del rendimiento de la transfección mediante el pretratamiento con PEI fue más pronunciada para las células HEK-293. El experimento de la Figura 5B muestra una actividad relativa del 21,1% ± 3,4% para las células de los pocillos no tratados, en comparación con el 100,0% ± 8,4% de los pocillos pretratados con PEI (un aumento de aproximadamente 5 veces). El pretratamiento con colágeno o PDL dio lugar a inducciones más modestas (aproximadamente de 2 a 3 veces en la Figura 5B). La menor mejora se observó con el colágeno, de forma similar a la menor mejora de la adhesión de las células HEK-293 que se observó anteriormente en la Figura 3B. Por último, en el caso de los fibroblastos MYS que se adhieren fuertemente, no se observó un efecto positivo significativo al utilizar factores de adhesión en el procedimiento de transfección. Las variaciones fueron generalmente inferiores al 20% para todas las condiciones experimentales. El experimento representativo que se muestra en la Figura 5C muestra, de hecho, un rendimiento de transfección ligeramente superior para los pocillos no tratados que para las placas pretratadas con PEI (actividad relativa del 117,7% ± 3,2% para los pocillos no tratados frente al 100,0% ± 4.8% para los pocillos pretratados con PEI, es decir, un rendimiento de transfección aproximadamente 1,2 veces mayor en el control).
El PEI mejora la transfección de las células débilmente ancladas. Los rendimientos de transfección se determinaron mediante ensayos de β-galactosidasa y se normalizaron con respecto a los rendimientos obtenidos con el recubrimiento de PEI de la placa de cultivo (al que se le asignó un valor arbitrario de 100,0%). El PEI y otros factores de fijación mejoraron la transfección de las líneas celulares con poca fijación, como las células PC-12 (gráfico A) y las células HEK-293 (gráfico B). No se observó ningún efecto significativo con las células de fijación fuerte, como los fibroblastos MYS (gráfico C). Las barras muestran la media ± desviación estándar de ensayos por triplicado, que son representativos de al menos dos experimentos independientes (* significativamente mayor que el control no tratado, p < 0,01).
Compilando los resultados de todos los experimentos realizados, la media de la inducción de pliegues (± desviación estándar) observada en el rendimiento de transfección de las células PC-12 ancladas a PEI en comparación con las células en los pocillos no tratados fue de 2.4 veces (± 0,1 veces; n = 3), mientras que la mejora con células HEK-293 fue de 6,3 veces (± 0,5 veces; n = 2). El análisis estadístico de la prueba t indica que ambos aumentos son significativos (p < 0,05). No se observó un aumento significativo de la transfección en los experimentos con células MYS, con un cambio promedio de 1,0 veces (± 0,3 veces; n = 2) por el pretratamiento con PEI (básicamente idéntico al rendimiento sin tratamiento).