ABT-263 : un inhibiteur de la famille Bcl-2 puissant et biodisponible par voie orale

Résultats

ABT-263 est un inhibiteur de la famille Bcl-2 biodisponible par voie orale. Les caractéristiques structurelles de l’ABT-737 qui confèrent des propriétés médicamenteuses indésirables résultent d’éléments de conception essentiels à l’inhibition d’une grande surface, d’une interaction protéine-protéine hydrophobe et d’une réduction de la liaison à l’albumine sérique (4-6). Pour améliorer l’efficacité orale de cette molécule relativement grande (MW >800), il a fallu trouver un juste équilibre entre l’affinité pour la cible, la puissance cellulaire et l’absorption orale. On a identifié trois sites clés le long du squelette de l’ABT-737 qui affectent l’équilibre des charges, le métabolisme et l’absorption orale (Fig. 1). Les analogues incorporant des modifications à ces positions ont été optimisés pour maximiser la relation pharmacocinétique/pharmacodynamique entre l’exposition orale chez les animaux et l’efficacité sur les lignées cellulaires tumorales humaines. Ces efforts ont abouti à l’identification d’ABT-263.

L’ABT-263 conserve une forte affinité pour Bcl-xL, Bcl-2 et Bcl-w, qui est inférieure à la limite de détection du test de polarisation de fluorescence (Ki ≤1 nmol/L), mais se lie plus faiblement à Mcl-1 et A1 (tableau 1). Ce schéma de sélectivité est similaire à celui de son prédécesseur ABT-737 et de la protéine Bad à BH3 seul (12). L’affinité subnanomolaire de l’ABT-263 pour Bcl-xL a été confirmée par un test de transfert d’énergie par résonance de fluorescence résolu dans le temps plus sensible qui montre que l’énantiomère (un stéréoisomère avec la configuration opposée du groupe morpholinoéthyle, utilisé comme contrôle moins actif) est ∼40 fois moins puissant.

Le profil pharmacocinétique de l’ABT-263 est caractérisé par de faibles valeurs de clairance plasmatique et de faibles volumes de distribution chez la souris, le rat, le chien et le singe, avec des demi-vies d’élimination plasmatique après une dose i.v. de 4,6 à 8,4 heures (tableau supplémentaire S1). La biodisponibilité après gavage oral était de ∼20 % chez les quatre espèces. En raison de sa faible solubilité aqueuse, ABT-263 présente une absorption orale limitée par une vitesse de dissolution prolongée. L’administration par voie orale dans des formulations à base de lipides, dans lesquelles le composé est nettement plus soluble, permet une meilleure absorption avec une biodisponibilité proche de 50 % et une demi-vie d’élimination orale de 8,9 heures chez le chien. Une courbe représentative de la concentration plasmatique du médicament après administration i.v. ou p.o. chez le chien est présentée dans la figure supplémentaire S1.

ABT-263 présente une cytotoxicité basée sur un mécanisme. Un certain nombre de petites molécules mimétiques de BH3 ont été rapportées pour lier les membres de la famille Bcl-2 avec une affinité modeste et induire l’apoptose dans les lignées cellulaires tumorales (21-23). Cependant, il a été récemment démontré que nombre de ces agents tuent les cellules de manière indépendante de Bax/Bak, ce qui remet en question la pertinence fonctionnelle de leur faible affinité pour les protéines Bcl-2 et les véritables mécanismes d’action de ces molécules (14). Par conséquent, il nous a semblé important de démontrer de manière robuste que l’apoptose induite par ABT-263 était le résultat direct de l’inhibition des protéines de la famille Bcl-2. Tout d’abord, l’activité cellulaire de l’ABT-263 a été évaluée dans la lignée cellulaire murine prolymphocytaire FL5.12 dépendante de l’interleukine 3 (IL-3). Le retrait de l’IL-3 induit l’apoptose de la FL5.12, en partie par la régulation à la hausse des facteurs proapoptotiques Bim et Puma (24, 25). La surexpression de Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) ou de Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) protège contre les effets du retrait de l’IL-3 par la séquestration de Bim et Puma (25). L’ABT-263, mais pas l’énantiomère, a inversé la protection conférée par la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-xL (EC50 = 60 et 20 nmol/L, respectivement ; Fig. 2A). L’ABT-263 n’a pas réussi à provoquer la mort cellulaire en présence d’IL-3, alors que les cellules FL5.12 n’étaient pas soumises à des stimuli proapoptotiques. La capacité de l’ABT-263 à tuer les cellules FL5.12-Bcl-2 ou FL5.12-Bcl-xL sous retrait de l’IL-3 a été significativement atténuée en présence de l’inhibiteur de caspase ZVAD, ce qui indique que la mort cellulaire est caspase dépendante (figure supplémentaire S2).

Pour déterminer si la cytotoxicité induite par l’ABT-263 peut être attribuée à la perturbation des interactions intracellulaires protéine-protéine de la famille Bcl-2, des études de coimmunoprécipitation ont été réalisées. L’ABT-263 a induit une diminution dose-dépendante des interactions Bim:Bcl-xL dans les 2 heures suivant le traitement des cellules FL5.12-Bcl-xL (figure supplémentaire S3). Des schémas similaires ont également été observés pour la perturbation des complexes Bim:Bcl-2 dans les cellules FL5.12-Bcl-2 (données non présentées), ce qui indique que l’ABT-263 rétablit la mort cellulaire dépendante de l’IL-3 en atténuant la capacité de Bcl-xL et de Bcl-2 à séquestrer les facteurs proapoptotiques tels que Bim. La capacité de l’ABT-263 à perturber les interactions protéine-protéine de la famille Bcl-2 a été confirmée dans un système à deux hybrides de mammifères (Fig. 2B). L’ABT-263 a inhibé l’interaction de VP16-Bcl-xS avec Gal4-Bcl-xL (CE50 apparente ∼50 nmol/L), alors que l’énantiomère était beaucoup moins efficace.

Pour interroger davantage le mécanisme d’action, l’activité de l’ABT-263 a été évaluée dans une série de cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) comprenant des cellules de type sauvage (WT) ainsi que des cellules déficientes en Bcl-x, Mcl-1 et Bax/Bak (DKO). L’ABT-263 a puissamment induit la mort cellulaire dans les cellules MEF Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/L) mais pas dans celles Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/L) (figure supplémentaire S4A). Cela confirme la capacité de l’ABT-263 à inhiber fonctionnellement Bcl-xL, mais pas Mcl-1, dans un contexte cellulaire et est conforme aux observations précédentes avec l’ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). L’énantiomère était inefficace dans les deux systèmes. ABT-263 était également inefficace (EC50 ≥10 μmol/L) pour tuer les cellules MEF WT ou DKO, ce qui est cohérent avec les rapports précédents (14). En revanche, l’étoposide, un agent cytotoxique général, ainsi que deux petites molécules mimétiques de BH3 rapportées , ont induit la mort cellulaire avec des EC50 similaires dans les quatre types de cellules MEF, ce qui suggère que ces composés induisent la mort cellulaire, au moins en partie, par des mécanismes indépendants de la famille Bcl-2 (Fig. supplémentaire. S4C).

Pour évaluer la capacité de l’ABT-263 à induire directement l’apoptose dans une lignée cellulaire tumorale humaine, la translocation de Bax et la libération de cytochrome c ont été surveillées dans la lignée cellulaire H146 de SCLC. Il a été démontré que la survie de la lignée H146 dépendait de Bcl-2 (25). L’ABT-263 a induit une diminution dose-dépendante du Bax cytosolique couplée à une augmentation du cytochrome c cytosolique dans les 2 heures suivant le traitement (Fig. 2C-i). L’énantiomère n’a pas été en mesure de provoquer une réponse similaire. L’activation de Bax et la libération de cytochrome c ont été confirmées par microscopie (Fig. 2C-ii). L’anticorps 6A7 anti-Bax, qui reconnaît spécifiquement la forme conformationnellement active de Bax, a été utilisé pour détecter le Bax activé dans les cellules H146. Conformément aux études de fractionnement, le traitement par l’ABT-263 a été associé à une augmentation substantielle du Bax activé. Cela correspondait à la libération du cytochrome c de la mitochondrie vers le cytosol, comme en témoignent la diminution des structures ponctuées et l’augmentation de la coloration cytosolique. L’ABT-263, mais pas son énantiomère, a également induit une augmentation de l’activité de la caspase-3 en fonction du temps, détectable à 2 heures et qui a atteint un pic à ∼6 heures (Fig. 2D). Cet effet était dépendant de la concentration, avec une CE50 ∼100 nmol/L au point de temps de 6 heures (Fig. 2D, encart). En revanche, la camptothécine, un inhibiteur de la topoisomérase I dont on sait qu’il induit l’apoptose mitochondriale et l’activation ultérieure des caspases (27, 28), n’a pu provoquer une augmentation de l’activité de la caspase-3 qu’après 24 heures (données non présentées). Ces données indiquent que l’ABT-263 agit directement pour inhiber Bcl-2 et Bcl-xL, libérant des facteurs proapoptotiques tels que Bim pour induire une activation rapide de la voie apoptotique mitochondriale.

Pour évaluer l’ampleur de l’activité cellulaire de l’ABT-263, un panel de lignées cellulaires tumorales humaines couvrant un éventail de types de tumeurs a été examiné. Conformément aux rapports précédents sur l’ABT-737 (12), l’ABT-263 a présenté une activité en monothérapie dans le SCLC et les hémopathies malignes, mais pas dans la majorité des autres types de tumeurs (données non présentées). Pour étudier de plus près l’activité dans ces types de tumeurs sensibles, l’ABT-263 a été examiné dans des panels de lignées cellulaires dérivées de SCLC (n = 22) et d’hémopathies malignes (n = 23). Dans chaque panel, l’ABT-263 a présenté une gamme de puissance, 32 % (SCLC) et 48 % (hématologique) des lignées cellulaires étant très sensibles (EC50 <1 μmol/L ; Fig. 3). L’énantiomère était >20 fois moins actif dans ces cellules sensibles (tableau supplémentaire S2).

L’administration orale d’ABT-263 entraîne la régression des tumeurs xénogreffées SCLC et ALL in vivo. Pour étendre ces observations in vivo, l’ABT-263 a été évalué dans des modèles de xénogreffes de flanc établis à partir de certaines des lignées cellulaires sensibles de SCLC et d’hématologie. Administré par voie orale, une fois par jour, à raison de 100 mg/kg pendant 21 jours consécutifs, l’ABT-263 a induit des réponses tumorales (RC) rapides et complètes qui ont été durables pendant plusieurs semaines après la fin du traitement chez tous les animaux porteurs de tumeurs H889 (SCLC) ou RS4;11 (ALL) (Fig. 4A). Un traitement similaire de souris portant des tumeurs H146 SCLC a induit des régressions rapides entraînant une RC chez 60 % des animaux et une RP chez 40 % d’entre eux (Fig. 4A). Un rebond tumoral progressif a été observé plusieurs semaines après la fin du traitement dans ce modèle. L’activité était dose dépendante dans le modèle de xénogreffe H146. Le traitement par ABT-263 à la dose de 50 mg/kg pendant 21 jours consécutifs a induit une RC chez 22 % et une RP chez 44 % des animaux, tandis que la dose de 25 mg/kg a induit une inhibition de la croissance tumorale statistiquement significative mais modeste, sans régression tumorale observée. ABT-263 a été bien toléré (<5% de perte de poids) à toutes les doses.

Pour corréler l’exposition de l’ABT-263 avec l’efficacité antitumorale, une étude pharmacocinétique à l’état d’équilibre a été réalisée dans laquelle des souris non porteuses de tumeurs ont reçu des doses p.o. une fois par jour pendant 3 jours, et les concentrations plasmatiques du médicament ont été déterminées après la troisième dose. La concentration plasmatique maximale (Cmax) et l’aire sous la courbe de concentration plasmatique (AUC) étaient toutes deux proportionnelles à la dose et augmentaient de façon à peu près linéaire (tableau supplémentaire S3). Une dose de 100 mg/kg, qui a produit un taux de réponse global de 100 % (taux de réponse global = RC + RP), a donné des valeurs de Cmax et d’ASC de 7,7 μmol/L et 90 μmol/L h, respectivement. L’exposition résultant d’une dose de 50 mg/kg, qui a suscité un taux de réponse global de 66 %, était de 5,4 μmol/L (Cmax) et de 54 μmol/L h (AUC). Ces données indiquent que les concentrations plasmatiques maximales du médicament ABT-263 allant de ∼5,4 à 7,7 μmol/L sont très efficaces.

ABT-263 augmente l’activité des agents chimiothérapeutiques in vivo. L’efficacité in vivo d’ABT-263 a été étudiée en association avec des agents thérapeutiques couramment utilisés dans plusieurs modèles agressifs d’hémopathies malignes. L’ABT-263 et le rituximab ont été examinés dans le modèle de xénogreffe de flanc de lymphome à cellules B DoHH2 (Fig. 4B). Administré quotidiennement à raison de 100 mg/kg par voie orale pendant 17 jours, l’ABT-263 a inhibé la croissance tumorale de 44 %. Une dose unique de 10 mg/kg de rituximab a entraîné une inhibition de 84 % de la croissance tumorale. Ni l’ABT-263 ni le rituximab seul n’ont permis une régression durable de la tumeur ; cependant, l’association a eu un effet supérieur, permettant d’obtenir 70 % de RC et 10 % de PR. Cette association a également entraîné une amélioration significative du retard de croissance tumorale (>700%) par rapport au rituximab seul (300%).

L’efficacité de l’ABT-263 seul et en association avec un régime R-CHOP modifié a également été évaluée dans un modèle de xénogreffe de flanc GRANTA-519 de lymphome à cellules du manteau (Fig. 4B). L’ABT-263 administré à raison de 100 mg/kg par voie orale pendant 21 jours consécutifs a entraîné une inhibition de 40 % de la croissance tumorale. En comparaison, le régime R-CHOP a inhibé la croissance tumorale de 68% avec une RC de 20%. L’association a entraîné des régressions tumorales spectaculaires et des réponses tumorales complètes chez tous les animaux testés, sans aucun signe de repousse tumorale dans quatre des neuf tumeurs évaluables.

Enfin, nous avons examiné la capacité de l’ABT-263 à potentialiser les effets de la chimiothérapie dans un modèle résistant à l’ABT-263. Dans le modèle de xénogreffe de flanc OPM-2 de myélome multiple (CE50 in vitro = 6,7 μmol/L), l’ABT-263 administré quotidiennement pendant 21 jours à la dose de 100 mg/kg n’a pas inhibé significativement la croissance tumorale (figure 4B). Le bortézomib administré à sa dose maximale tolérée (1 mg/kg i.v., qd ×3) a inhibé la croissance tumorale de 70 % sans CR. L’ABT-263 a renforcé l’efficacité du bortézomib, l’association entraînant une inhibition de la croissance tumorale de 95 % et un taux de RC de 40 %.

L’ABT-263 induit une thrombocytopénie rapide mais réversible. Nous avons récemment rapporté que l’ABT-737 induit une thrombocytopénie rapide et réversible chez les animaux résultant de l’inhibition des protéines de la famille Bcl-2 et de l’induction de l’apoptose dans les plaquettes circulantes sans toxicité pour la moelle osseuse (29). Comme prévu, l’ABT-263 induit également une thrombocytopénie. Après l’administration d’une dose unique par voie orale chez le chien, le nombre de plaquettes circulantes a diminué dans les 2 heures, avec un nadir plaquettaire à 6 heures et des signes de rebond dans les 24 heures (Fig. 5A). Pour déterminer les effets d’une administration prolongée, nous avons examiné la relation pharmacocinétique/pharmacodynamique après l’administration de doses quotidiennes multiples chez le chien (Fig. 5B). L’ABT-263 a été administré par voie orale à raison de 2 mg/kg/j pendant 6 jours, puis augmenté à 6 mg/kg/j pendant 6 jours supplémentaires. La numération plaquettaire et les concentrations plasmatiques du médicament ont été évaluées 6 heures après le traitement afin de saisir les nadirs plaquettaires probables des jours 1 à 4 et des jours 7 à 11. À la dose de 2 mg/kg, la numération plaquettaire a diminué d’une valeur initiale de ∼250 000/μL à ∼125 000/μL à la deuxième dose, puis est restée stable pour les doses restantes. La concentration plasmatique du médicament obtenue 6 heures après le traitement (C6h) est restée constante à des valeurs comprises entre 3,6 et 4,2 μmol/L. D’après le profil pharmacocinétique de l’ABT-263 (figure supplémentaire S1), la C6h est environ 2 fois plus faible que la Cmax, ce qui indique que les concentrations plasmatiques maximales du médicament obtenues après plusieurs doses de 2 mg/kg sont de ∼7 à 8 μmol/L. Ces concentrations sont similaires à celles obtenues après une dose de 100 mg/kg administrée par voie orale chez la souris. Lorsque la dose d’ABT-263 a été augmentée à 6 mg/kg/j, le nombre de plaquettes a diminué à ∼50 000/μL dès le deuxième jour de cette dose plus élevée et est resté relativement constant pendant toute la durée de l’étude. Les valeurs de C6h à ce niveau de dose étaient comprises entre 10,2 et 14,8 μmol/L (Cmax, 20-30 μmol/L). L’ABT-263 a été bien toléré dans cette étude, sans mortalité ni signes cliniques indésirables. Cependant, quelques hématomes étaient apparents au niveau du site de ponction veineuse, ce qui correspond à des altérations de l’hémostase. Ces données indiquent qu’une exposition quotidienne répétée d’ABT-263 à des niveaux montrés très efficaces dans des modèles murins entraîne une réduction de ∼50 % des plaquettes circulantes chez le chien. En outre, des concentrations plasmatiques plusieurs fois supérieures au niveau efficace sont bien tolérées, le nombre de plaquettes circulantes étant réduit à ∼50 000/μL.