Résumé
L’ultracentrifugation en gradient de densité de saccharose est une technique puissante pour fractionner des macromolécules comme l’ADN, l’ARN et les protéines. Pour cela, un échantillon contenant un mélange de macromolécules de différentes tailles est déposé à la surface d’un gradient dont la densité augmente linéairement de haut en bas. Pendant la centrifugation, les macromolécules de différentes tailles sédimentent à travers le gradient à des vitesses différentes. La vitesse de sédimentation dépend, en plus de la force centrifuge, de la taille, de la forme et de la densité des macromolécules, ainsi que de la densité et de la viscosité du gradient. De cette façon, les macromolécules sont séparées par leur taille, les plus grosses sédimentant vers le bas et les plus légères restant près du haut du gradient. Cette méthode s’est avérée particulièrement efficace pour le fractionnement des grandes molécules d’ADN et a été largement utilisée pour mesurer l’induction et la réparation des cassures de l’ADN après exposition à des facteurs clastogènes. Nous décrivons ici une adaptation de cette méthode qui peut être utilisée pour l’analyse de l’ADN nouvellement synthétisé formé pendant la réplication de l’ADN. Grâce à l’analyse de la taille de l’ADN naissant dans des gradients alcalins de saccharose, les variations de l’activité de réplication peuvent être mesurées après exposition des cellules à des agents endommageant l’ADN. La méthode est particulièrement utile car elle permet de distinguer les effets des dommages à l’ADN sur l’élongation de la chaîne de ceux sur l’initiation du réplicon, ce qui est essentiel pour une analyse approfondie du point de contrôle intra-phase S. Cette capacité rend la technique unique et justifie la mise au point d’une nouvelle méthode d’analyse. Cette capacité rend la technique unique et justifie sa nature quelque peu laborieuse.