Biosynthèse de trans-4-.hydroxyproline par des souches recombinantes de Corynebacterium glutamicum et Escherichia coli

Construction de souches recombinantes productrices de trans-Hyp

Il existe plusieurs gènes faisant l’objet de spéculations comme gène putatif de la L-proline 4-hydroxylase dans la base de données, y compris les gènes de Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 et Dactylosporangium. sp. En utilisant la PCR, nous avons cloné et obtenu les gènes putatifs de P4H de P. stutzer et B. bronchiseptica RB50, nommés p4hP et p4hB. Ils ont été ligaturés aux plasmides correspondants après digestion et convertis à C. glutamicum et E. coli, respectivement. La longueur de p4hP était de 918 bps et celle de p4hB de 924 bps. Ces séquences étaient 100% identiques aux gènes rapportés dans NCBI. Le gène de trans-P4H de Dactylosporangium sp. (p4hD) a été exprimé dans E. coli avec succès et peut transformer la L-proline avec de bonnes propriétés enzymatiques. La longueur de p4hD était de 816 pb codant pour un polypeptide de 272 acides aminés avec un poids moléculaire de 29 715 daltons. Dans cette étude, la p4hD a été appliquée avec quelques modifications sur les bases nucléaires. La séquence du gène original de p4hD a été analysée (http://www.kazusa.or.jp/codon/) et les résultats ont montré qu’il y avait quelques codons rares pour C. glutamicum et E. coli. Il a été signalé que les codons rares sont fortement associés à un faible niveau d’expression des protéines. Il a souvent été démontré que l’optimisation des codons pour l’expression de protéines hétérologues augmente considérablement l’expression des protéines. Ainsi, les codons rares du gène p4hD ont été remplacés par ceux utilisés avec une fréquence élevée dans C. glutamicum et le contenu GC a été ajusté de 73% à 61% par conversion synonyme, ce qui était proche de celui de C. glutamicum. Le gène modifié de p4hD a été synthétisé selon les modifications ci-dessus (fichier additionnel 1).

L’expression de P4H est un des aspects importants sur la construction de la voie de biosynthèse trans-Hyp. La figure 2 montre la SDS-PAGE des trans-P4H exprimés dans C. glutamicum et E. coli recombinants. Tous les trans-P4H recombinants ont été exprimés sous forme de protéines solubles sans corps d’inclusion. Il est évident que les trans-P4Hs recombinantes dans E. coli ont été exprimées beaucoup plus que celles dans C. glutamicum (Figure 2). De nombreux facteurs ont une influence sur l’expression des protéines étrangères, notamment les promoteurs, le système hôte-vecteur et les conditions de culture, etc. Comme il s’agissait de la première expression de trans-P4Hs dans C. glutamicum, des études plus complètes telles que la sélection des promoteurs et l’optimisation des conditions de culture seront envisagées dans nos travaux futurs.

Comparaison des activités de P4H

Les oxygénases sont largement appliquées dans l’industrie car elles peuvent catalyser l’oxyfonctionnalisation hautement spécifique des liaisons C-H non activées dans des conditions douces, notamment en transférant l’oxygène moléculaire à un substrat . Les P4H appartiennent à une famille de dioxygénases dépendantes des 2-oxoacides, qui sont des protéines monomères et utilisent des substrats monomères plutôt que polymères. Les activités des trans-P4H utilisant des cellules entières recombinantes dans cette étude ont été mesurées (Tableau 1). Nos données ont indiqué que le niveau de protéine exprimée et l’activité enzymatique étaient plus élevés à 30°C. Les résultats ont également montré que les plasmides étaient très stables car les stabilités plasmidiques des souches recombinantes d’E. coli et de C. glutamicum étaient toutes supérieures à 98% à la fin de la fermentation.

Les cellules recombinantes avec l’expression de différents gènes ont montré différents niveaux d’activités catalytiques envers la L-proline. L’activité du trans-P4H exprimé par E. coli BL21/ pET28a-p4hD était la plus élevée parmi toutes les souches recombinantes construites. Les nouveaux gènes clonés et exprimés de P. stutzeri et B. bronchiseptica ont également montré des activités intéressantes. Quant aux différentes souches hôtes, E. coli était mieux représentée que C. glutamicum, ce qui peut être lié à la performance du plasmide correspondant. Quatre souches productrices de L-proline de C. glutamicum ont été utilisées comme souches hôtes d’expression et les souches recombinantes obtenues ont montré différentes activités enzymatiques. L’activité enzymatique spécifique la plus élevée parmi les souches de C. glutamicum était de 40,7 U/mg – cellule humide par C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Cependant, l’activité enzymatique spécifique de la souche recombinante E. coli/pET28a -p4hD atteignait 60,4 U/mg – cellule humide. La croissance des trois souches d’E. coli recombinant était similaire. Mais il y avait une différence significative entre les souches recombinantes de C. glutamicum. Les souches de C. glutamicum recombinantes ayant des activités enzymatiques spécifiques plus élevées ont moins poussé que celles ayant des activités enzymatiques spécifiques plus faibles. De plus, l’activité enzymatique de E. coli BL21 /pET28a -p4hD était similaire à celle de E. coli W1485/pWFH1 et supérieure à celle de E. coli BL21/pET24-p4h1 de . La p4hD de E. coli W1485/pWFH1 était la p4hD originale de Dactylosporangium sp. tandis que la p4hD de E. coli BL21/pET24-p4h1 a été modifiée. Bien que l’optimisation des codons dans cette étude ait été conçue pour C. glutamicum, les résultats ont indiqué qu’elle était également réussie dans E. coli.

Production de trans-Hyp dans des flacons

La production de trans-Hyp par différentes souches recombinantes de C. glutamicum et E. coli a également été présentée dans le tableau 1. Les rendements en trans-Hyp par ces souches recombinantes dépendaient à la fois de l’activité enzymatique de la P4H et de la croissance cellulaire. E. coli BL21/ pET28a-p4hD a eu le rendement le plus élevé, ce qui coïncide avec son activité enzymatique spécifique. Bien que les souches d’E. coli recombinantes se soient développées de manière similaire dans le milieu de production, il y avait une différence significative dans la production de trans-Hyp qui n’a pas gardé le même niveau avec les activités enzymatiques spécifiques. Les productions de trans-Hyp par les souches recombinantes de C. glutamicum étaient également beaucoup moins importantes que celles de E. coli BL21/pET28a-p4hD. Cela était dû à la fois à la moindre expression du trans-P4H et à la moindre croissance cellulaire de C. glutamicum. La production de L-proline de quatre souches de C. glutamicum était également inférieure à 1 g/L. Il y avait peu de différence de production de trans-Hyp entre les souches recombinantes de C. glutamicum avec le même gène p4hD, malgré le fait que certaines souches avaient une meilleure performance enzymatique et une meilleure production de proline.

L’utilisation des souches recombinantes pour synthétiser directement le trans-Hyp à partir du glucose par fermentation a été réalisée puisque les enzymes et les précurseurs nécessaires au processus étaient disponibles. Les trans-P4H étrangères surexprimées ont catalysé l’hydroxylation de la L-proline en position trans-4, tandis que le 2- cétoglutarate a été fourni par le glucose via le cycle TCA, puis décarboxylé par oxydation en succinate (Figure 1). Il a été signalé que la proline était requise dans la production d’Hyp par E. coli recombinant uniquement avec le gène p4h. Le carbone de la proline ajoutée pendant la fermentation n’a été utilisé que pour la synthèse d’acides aminés à partir des intermédiaires du cycle TCA et non pour la gluconéogenèse. Cependant, l’Hyp accumulé était à un niveau relativement élevé même sans l’ajout de proline dans cette étude. On peut comprendre que Corynebacterium possède la puissante voie de biosynthèse de la proline. La voie de biosynthèse de la proline a également été identifiée chez E. coli, ce qui peut contribuer à la synthèse de trans-Hyp par les souches recombinantes de E. coli. La modification de la voie de la proline dans E. coli a augmenté le rendement de l’Hyp, tandis que la formation de l’Hyp peut également soulager la rétro-inhibition de la proline. La quantité de proline (0-4 mM) a favorisé la production de trans-Hyp. Cependant, l’addition continue de L-proline n’a pas amélioré le rendement de production de manière significative (Tableau 2). Dans cette étude, le temps de culture était significativement inférieur à ceux rapportés dans la littérature, ce qui pourrait être attribué aux différents milieux utilisés et indique également qu’il existe un grand potentiel d’optimisation. En fait, 2,28 g/L de trans-Hyp ont été produits par E. coli recombinant sans ajouter de L-proline dans des flacons avec une petite modification des milieux et 6,72 g/L ont été obtenus en ajoutant seulement 4 mM de L-proline.

Afin d’augmenter davantage la biosynthèse de trans-Hyp par C. glutamicum et E. coli recombinants, des approches alternatives doivent également être considérées. Dans E. coli, la dégradation de la proline doit être surmontée. Bien que la production de trans-Hyp par un mutant putA de E. coli n’ait pas été améliorée, le rendement basé sur la proline utilisée a été considérablement amélioré. Chez C. glutamicum et E. coli, l’expression de la P4H recombinante comme l’une des oxygénases est impliquée dans le métabolisme physiologique des cellules hôtes, y compris le cofacteur, le co-substrat et l’oxygène. De plus, sans une puissante voie de synthèse de la proline dans E. coli, la disponibilité et le transport du substrat limiteront sérieusement la transformation.