- Abstract
- 1. Introduction
- 2. Étude de cas (description clinique)
- 3. Méthodes
- 3.1. Modélisation structurelle
- 4. Résultats
- 4.1. Études structure-fonction
- 4.2. Effets de la formation de dimères
- 5. Discussion
- 6. Conclusion
- Abréviations
- Data Availability
- Consentement
- Conflits d’intérêts
- Contributions des auteurs
- Financement
- Reconnaissance
Abstract
Contexte. La protéine ATP-binding cassette, sous-famille D, membre 1 (ABCD1) est un semi-transporteur peroxysomal qui permet la dégradation des acides gras à très longue chaîne (AGTLC). Les variants pathogènes d’ABCD1 provoquent l’accumulation d’AGTLC dans divers tissus et fluides corporels, ce qui entraîne une maladie appelée adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD). Cette maladie est le plus souvent marquée par une insuffisance corticosurrénale et une concentration élevée d’AGTLC, et présente des niveaux variables d’atteinte neurologique selon le phénotype. Par exemple, la forme Addison-only de l’X-ALD n’a pas d’impact neurologique, alors que la forme cérébrale de l’X-ALD entraîne souvent une perte sensorielle sévère, une altération des fonctions motrices, un déclin cognitif et le décès. Méthodes. Une variante pathogène nouvellement caractérisée et suspectée dans ABCD1 a été analysée en utilisant notre plateforme informatique des protéines (PIP). Des études moléculaires personnalisées au niveau des protéines ont été réalisées sur les données des tests génétiques, complétant ainsi l’analyse et l’étude clinique. Résultats. Un cas d’adrénomyéloneuropathie à l’âge adulte (AMN) et une nouvelle variante d’ABCD1 sont présentés. La protéine ABCD1 unique est discutée, et le cas du proband est comparé aux rapports existants sur l’AMN. Conclusions. La fusion de données provenant de sources multiples a été combinée dans une approche globale permettant une évaluation enrichie de la maladie et du pronostic du patient. Une modélisation moléculaire a été réalisée sur le variant pour mieux caractériser sa signification clinique et confirmer sa pathogénicité.
1. Introduction
La protéine ATP-binding cassette, sous-famille D, membre 1 (ABCD1) fait partie de la superfamille des transporteurs à cassette liant l’ATP, qui se compose de protéines transmembranaires responsables du passage des lipides, des métabolites et d’autres molécules entre les cellules ou les structures intracellulaires. Elle est codée par ABCD1, un gène situé à Xq28 . ABCD1 est un semi-transporteur peroxysomal qui importe les acides gras à très longue chaîne (AGTLC) dans le peroxysome en se liant à l’ATP. Un ABCD1 dysfonctionnel est incapable de déplacer les AGTLC vers le peroxysome pour qu’ils soient dégradés, ce qui entraîne une accumulation d’AGTLC dans les fluides et les tissus corporels. Ce niveau anormal d’AGTLC est un biomarqueur caractéristique de l’adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD), la maladie peroxysomale la plus courante. L’X-ALD est une maladie génétique principalement associée à la démyélinisation, à la neurodégénérescence et à l’insuffisance corticosurrénale. Plus de 800 variantes ont été signalées dans le gène ABCD1. Malgré cela, aucune corrélation claire entre le génotype et le phénotype n’a été observée.
Les hommes hémizygotes présentent généralement les symptômes les plus importants, tandis que les femmes hétérozygotes développent souvent un degré moindre d’invalidité plus tard dans la vie . Les trois phénotypes classiques sont la maladie d’Addison seule, l’adrénomyéloneuropathie (AMN) et l’ALD cérébrale. Les personnes atteintes de la forme de la maladie d’Addison uniquement présentent généralement une insuffisance corticosurrénale entre 2 et 7 ans. La dégénérescence neurologique n’est pas présente au départ, mais elle se développe souvent avec l’âge. La NMA se manifeste généralement entre la troisième et la quatrième décennie de la vie et touche principalement la moelle épinière. La caractéristique clinique principale est souvent une raideur et une faiblesse progressives des jambes. Une insuffisance surrénalienne est constatée chez environ 2/3 des patients atteints d’AMN, et des modifications cérébrales affectent environ la moitié d’entre eux. L’ALD cérébrale est le phénotype le plus grave, où la démyélinisation cérébrale entraîne un déclin rapide de l’audition, de la vue, de la fonction motrice et de la cognition . Le plus souvent trouvée chez les enfants ou les adolescents, cette variante de l’ALD X entraîne souvent la mort dans les 2 à 4 ans suivant la présentation des symptômes .
Ce rapport détaille l’histoire d’un proband diagnostiqué dans la trentaine avec l’AMN. L’analyse moléculaire du gène ABCD1 a identifié une variante de signification incertaine chez cet individu. Il est intéressant de noter que cette variante a été déclarée pathogène dans la base de données des mutations de l’ALD, mais les informations concernant le cas clinique n’ont pas été publiées. Le cas clinique de notre proband est inclus pour mieux soutenir la pathogénicité de cette variante ABCD1. La plate-forme informatique des protéines (PIP) a été utilisée pour une modélisation moléculaire complète afin de caractériser davantage la signification de cette variante et de clarifier le diagnostic du proband.
2. Étude de cas (description clinique)
Le proband était un homme de 31 ans qui s’est présenté pour une évaluation d’une condition neurologique progressive. Les symptômes de cette affection sont apparus pour la première fois il y a deux ans, lorsque le proband a commencé à trébucher de plus en plus souvent. Il a ensuite ressenti une faiblesse et une raideur musculaires généralisées, ainsi qu’un nouveau dysfonctionnement de la marche. Pour lutter contre ce problème, le proband a utilisé un déambulateur à roulettes pour l’aider à se déplacer au cours des sept derniers mois. Il a également développé une incontinence urinaire. En outre, il a signalé un brouillard cérébral, des pertes de mémoire, des déficits d’attention, de l’anxiété et de la fatigue. En conséquence, les tâches mentales de base prenaient plus de temps à accomplir. Selon le proband, la consommation d’alcool exacerbait ces déficits. Enfin, le proband a perdu 20 livres depuis le début de son état et n’a pas réussi à reprendre du poids malgré des efforts concertés. Cette perte de poids était en partie due aux symptômes de nausées et de vomissements, qui étaient plus fréquents le matin.
Lors de l’examen physique, le proband était incapable de se lever d’une position assise sans l’aide de ses mains. Une dysarthrie ataxique légère a été identifiée. Les tests de fixation visuelle ont révélé des saccades en onde carrée peu fréquentes. Les poursuites lentes étaient saccadées, et il a démontré des saccades lentes et complètes à la fois verticalement et horizontalement. Les réflexes d’étirement étaient pathologiquement vifs dans les extrémités supérieures. Le proband avait également des réflexes d’étirement mitotiques pathologiquement vifs dans les extrémités inférieures, y compris un clonus soutenu aux chevilles. La proprioception des gros orteils était modérément altérée. Une faiblesse légère de la distribution des motoneurones supérieurs a été observée dans les extrémités inférieures, avec une épargne des iliopsoas. Le test talon-tibia a révélé une dyssynergie. Lorsqu’il se déplace, le patient regarde ses pieds et se déplace avec une foulée réduite. Ses genoux étaient en hyperextension, il avait tendance à marcher sur la pointe des pieds et, occasionnellement, il glissait sur ses pieds. Le signe de Romberg était présent. En position debout, des mouvements tremblants étaient présents dans ses jambes, principalement dans les quadriceps. Le proband a tourné de 360 degrés sur 3 essais, ce qui a nécessité 9 à 15 pas par tour. Ses réflexes posturaux étaient anormaux, et le test de « traction » était à -3.
L’IRM du cerveau était normale, et l’IRM de la colonne cervicale a révélé des résultats suggérant une atrophie légère et diffuse de la moelle épinière. Il n’y avait aucun signe de dégénérescence combinée subaiguë ou d’une autre maladie acquise de la moelle épinière (figure 1). Il avait été traité pour la maladie de Lyme, car ses titres d’IgM de Lyme étaient positifs, mais aucune amélioration significative n’avait été enregistrée. Son liquide céphalo-rachidien était décrit comme acellulaire. L’évaluation du VIH, du HTLV1, de l’hépatite C, de l’hépatite B et du cytomégalovirus est revenue négative. Les antécédents familiaux de symptômes similaires n’ont pas pu être établis, car la connaissance du proband de leurs antécédents médicaux était limitée (figure 2).
Le profil des acides gras peroxysomaux du proband a été obtenu après les tests et l’imagerie précédents. Des concentrations anormales de C26 : 0, C24/C22 et C26/C22 étaient présentes, ce qui suggérait une hémizygosité pour l’adrénomyéloneuropathie liée à l’X. L’hormone adrénocorticotrope était mesurée à 528 pg/mL (RR : 7,2-63). Un séquençage et une analyse de délétion/duplication du gène ABCD1 ont alors été réalisés. Le proband était hémizygote pour une variante de signification incertaine dans ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Cette variante n’était pas présente dans la base de données en ligne ExAC, mais elle était répertoriée comme pathogène dans la base de données des mutations de l’ALD. Deux variants similaires, c.1596A>G (p.Lys533Glu) et c.1598A>G (p.Lys533Arg), ont également été rapportés précédemment comme cliniquement significatifs .
3. Méthodes
3.1. Modélisation structurelle
La séquence de la sous-famille D membre 1 de la cassette de liaison à l’ATP humaine (connue sous le nom d’ABCD1) est probablement une protéine de transport, qui a une région de liaison aux nucléotides avec un pli qui peut agir comme une sous-unité de liaison à l’ATP avec une activité ATPase. Il est connu qu’une dimérisation correcte est nécessaire pour former un transporteur actif. ABCD1 est un membre de la sous-famille ALD qui participe à l’importation peroxysomale des acides gras dans les organelles. Ces transporteurs ABC peroxysomaux sont des » demi-transporteurs « , ce qui signifie qu’ils ont besoin d’une demi-molécule de transporteur partenaire – la forme fonctionnelle est toujours homodimérique ou hétérodimérique. ABCD1 est supposé être la clé du transport peroxysomal ou du catabolisme des acides gras à très longue chaîne. ABCD1 est connu pour interagir avec PEX19, et est codé par le gène ABCD1, qui a été pris de la séquence d’accession de référence NCBI : NP_000024 : version NP_000024.2, qui est codée pour la séquence d’acides aminés ; et a été utilisée pour la modélisation assistée par ordinateur. Des simulations de Monte Carlo ont été effectuées sur le mutant pour permettre des changements régionaux locaux pour les 745 acides aminés pleine longueur.
Le raffinement des rayons X pour Monte Carlo a été construit en utilisant la méthode YASARA SSP/PSSM . La structure a été relaxée au champ de force YASARA/Amber en utilisant des potentiels basés sur la connaissance dans YASARA. Les chaînes latérales et les rotamères ont été ajustés à l’aide de potentiels basés sur la connaissance, de recuit simulé avec un solvant explicite et de petites simulations d’équilibrage utilisant le protocole de raffinement de YASARA. La structure complète a été modélisée, en comblant les lacunes ou les parties non résolues à partir des rayons X.
Le raffinement des modèles finalisés a été effectué en utilisant soit le module LC-MOD de Schrodinger basé sur la méthode Monte Carlo, soit les protocoles NAMD2. Ces raffinements ont commencé par le raffinement initial et la variante générés par YASARA . La superposition et le raffinement ultérieur des régions qui se chevauchent permettent d’obtenir un modèle complet pour l’ABCD1. Les structures finales ont été soumises à une optimisation énergétique avec gradient conjugué PR avec un diélectrique dépendant de R.
La cohérence des atomes a été vérifiée pour tous les 745 acides aminés (12 201 atomes) du modèle de type sauvage complet (WT) et 745 acides aminés (12 221 atomes) pour la variante, en vérifiant l’exactitude du nom de la chaîne, des dièdres, des angles, des torsions, des non-liaisons, de l’électrostatique, du typage des atomes et des paramètres. Un modèle de dimère est prédit, qui consiste en 24 402 atomes, y compris les cofacteurs et les ions. Chaque modèle a été exporté dans les formats suivants : Maestro (MAE), et YASARA (PDB). La manipulation des modèles a été effectuée avec Maestro (Macromodel, version 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010), ou Visual Molecular Dynamics (VMD) . Les analyses ont été accentuées sur la région N-terminale contenant les 350 premiers acides aminés étant donné la longueur et la distance C-terminale du site de mutation.
La recherche de dynamique Monte Carlo (MC hybride ou via l’échantillonnage MDS amélioré) a été complétée sur chaque modèle pour l’échantillonnage conformationnel, en utilisant des méthodes précédemment décrites dans la littérature . En bref, chaque système de variante ABCD1 a été minimisé avec des contraintes relâchées en utilisant soit la méthode de la descente la plus rapide, soit la méthode du gradient conjugué, puis on l’a laissé se soumettre aux critères de recherche MC, comme indiqué dans la littérature. Le but principal de MC, dans ce scénario, est d’examiner toute variabilité conformationnelle qui peut se produire avec différentes mutations dans la région proche de la mutation et l’effet possible sur la liaison ou le traitement de l’ADN avec l’ABCD1.
4. Résultats
4.1. Études structure-fonction
Pour WT par rapport au variant p.K533E, nous avons trouvé que la stabilité de l’objet à partir de calculs énergétiques pour le ΔG par acide aminé reste relativement la même, de sorte que WT a une stabilité de l’objet de 114,67 kcal/mol∗Å2. Le variant p.K533E entraîne une augmentation nette de l’énergie libre de 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, ce qui pourrait être déstabilisant pour la région locale . Cette stabilité d’objet était positive indiquant que certains changements dynamiques sont probables avec une simulation moléculaire pour l’échantillonnage conformationnel. Ainsi, nous avons examiné les résidus locaux et déterminé qu’un calcul électrostatique peut être utile pour expliquer le changement de fonction. Le modèle moléculaire pour la structure complète et sa forme variante sont donnés (Figure 3(a)) en utilisant nos méthodes de pointe, qui ont été établies . Le modèle dimérique est critique pour la fonction et montre des interactions importantes au site de la mutation qui sont perturbées par la mutation variante.
Les résidus locaux dans la coupure de 12 Å près du site de la variante (p.K533E) comprennent des résidus des deux monomères. Le monomère contenant le variant (monomère 1, carbones gris) a les résidus proches suivants avec des interactions en position 533 : E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535, et K624 (Figure 3(b)). Cette structure variante (p.Lys533Glu) a été analysée et une perturbation plus directe de l’environnement local a été indiquée par le basculement de la charge positive de la lysine (+) vers une charge négative de l’acide glutamique (-) qui était assez perturbante pour les résidus chargés adjacents (ci-dessus). En particulier, les résidus K624, E499 et Y532 sont placés dans des interactions différentes (figure 3(b)). Le ΔG local par acide aminé augmente une valeur positive nette correspondant à une stabilité défavorable dans la poche et une dynamique plus longue serait nécessaire pour déterminer l’effet global mais on peut s’attendre à ce qu’il soit déstabilisant. Le résidu K533E a des interactions intéressantes avec Q472, I474, I475, et E499. K533E se trouve dans une région hélice-hélice où sa chaîne latérale chargée est positionnée vers l’extérieur par rapport à des espèces de charge opposée ; il existe également une certaine interaction hélice-hélice avec les hélices adjacentes (figures 3(b) et 3(c)). Les mêmes résidus sont impliqués dans la variante, mais la position est modifiée pour plusieurs des résidus, notamment P534, P535 et K624 (figure 3(c)). Cette interaction pourrait expliquer l’altération de la fonction due à un changement de comportement dynamique pour la stabilité structurelle locale (figure 3(c)). Les calculs électrostatiques ont été complétés pour une analyse plus approfondie (Figure 4). En particulier, les résidus K624, E499, et Y532 sont placés dans des interactions différentes (Figure 3(b)). Le ΔG local par acide aminé augmente une valeur positive nette correspondant à une stabilité défavorable dans la poche et une dynamique plus longue serait nécessaire pour déterminer l’effet global mais on peut s’attendre à ce qu’il soit déstabilisant.
4.2. Effets de la formation de dimères
L’électrostatique de cartographie a été accomplie en utilisant le calcul de Poisson-Boltzmann pour la solvatation sur la structure entière de 745 acides aminés. Les effets des changements ont été fortement prononcés sur la distribution électrostatique avec une coupure de +3 KT/E pour les deux. La particule WT (tous les 745 aa) montre une distribution distincte de la charge autour de K533, qui présente peu de régions chargées négativement et de grandes poches neutres en raison des riches résidus hydrophobes présents dans les hélices mentionnées ci-dessus. La mutation de la thréonine semble changer la distribution des charges et éloigne les positions des charges négatives les unes des autres tout en augmentant la taille des régions neutres (Figures 4(a) et 4(b)). La région locale p.K533E est chargée de manière à faire correspondre le résidu lysine positif avec les résidus d’acide glutamique adjacents (à moins de 6 Å) (figure 4(b)). Inversement, le résidu K533 a des charges positives qui sont impactées par les résidus situés à moins de 6 Å, à savoir E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 et K624 (Figure 4(a)) . Le variant p.K533E ne semble pas avoir d’effet sur le dimère lui-même (Figures 3 et 4), puisque le variant est distal par rapport à l’interface entre les monomères. Cependant, il y a une perturbation significative dans le voisinage local où la lysine est nativement insérée dans une poche avec ses résidus voisins qui sont chargés de manière opposée et s’engagent dans des liaisons H et des interactions de pont salin, ce qui est perdu avec la charge négative de la substitution de l’acide glutamique (Figure 3).
5. Discussion
Pour les patients atteints d’AMN, les options de traitement sont actuellement limitées. Cependant, des recherches récentes avec des modèles de souris posent une solution potentielle. Chez les patients X-ALD, l’accumulation des AGTLC s’accompagne d’une augmentation des niveaux d’espèces radicalaires de l’oxygène. Ces radicaux favorisent la progression de la maladie, endommageant les tissus et provoquant finalement l’apparition de symptômes neurologiques. Des souris atteintes d’analogues de l’X-ALD ont été traitées avec succès par un mélange d’antioxydants, ce qui a permis de maîtriser les niveaux de radicaux et de stopper ce processus pathogène . Si les essais ultérieurs continuent de s’avérer prometteurs, il est possible que notre proband et d’autres patients atteints d’AMN puissent un jour être traités de manière similaire.
Bien que notre proband ait présenté une variante mal comprise de l’ABCD1, son cas ne différait pas significativement du phénotype typique de l’AMN. Les symptômes ont commencé à la fin de la vingtaine, ce qui correspond parfaitement à la tranche d’âge attendue de 20 à 40 ans. L’AMN se caractérise par une atteinte de la moelle épinière, ce qui a été confirmé par les IRM du proband. La faiblesse de ses jambes et l’anomalie de sa démarche sont caractéristiques de la maladie, tout comme l’incontinence urinaire. Les vomissements et les nausées sont associés à l’insuffisance surrénale, tandis que les anomalies de la parole et de l’esprit du patient pourraient être associées à des modifications cérébrales. Malgré cela, il faut dire qu’un patient présentant le même variant ABCD1 que notre proband pourrait présenter des symptômes différents. Les variants pathogènes d’ABCD1 entraînent rarement des phénotypes prévisibles – même lorsqu’une version identique est possédée par des membres de la famille .
L’informatique protéique dérivée des calculs de mécanique statistique appliqués à la modélisation moléculaire pour les variants par rapport au type sauvage nous donne des indications claires pour le dysfonctionnement du comportement normal de la protéine à un niveau moléculaire qui aurait un impact sur la fonction. Par exemple, nous avons constaté que la variante p.K533E entraîne une augmentation nette de l’énergie libre de 2,321 kcal/aamolÅ2, ce qui déstabilise la région locale dans les 12 Å du résidu K533. En raison du changement structurel local atténué par les résidus de l’épine dorsale et les changements d’interaction de la structure secondaire (réseau de liaison H non montré) permettent au mouvement corrélé de se propager dans toute la structure frustrant davantage la formation appropriée du dimère.
En raison de la rareté de la variante ABCD1 de notre proband, le laboratoire commercial n’a pas été en mesure de nommer avec confiance la variante pathogène. De plus, les défis logistiques et la petite taille de la famille du proband ont rendu l’analyse de ségrégation familiale peu pratique. Par conséquent, ce processus n’a pas pu être mené à bien pour nous aider à mieux comprendre la signification de sa variante. Heureusement, la modélisation moléculaire nous a offert une autre opportunité. La modélisation moléculaire des protéines a confirmé les soupçons selon lesquels cette variante aurait un impact sur la fonction des protéines d’une manière cliniquement significative. Il n’y avait aucun soupçon que ce variant n’aurait pas été classé pathogène étant donné l’altération grossière de la structure, ce qui a été fortement soutenu par l’analyse PIP.
6. Conclusion
En conclusion, nous rapportons un proband avec un variant rare dans ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Le manque d’informations sur ce variant a empêché la société de tests génétiques de classer son variant comme pathogène, mais les charges moléculaires semblent indiquer que cette région de la protéine est significativement perturbée par rapport à l’équilibre (Figure 3(b)). L’utilisation de la modélisation de la protéine a également fourni des informations à incorporer dans le tableau clinique plus large du proband. De plus, un exemple de la pathogénicité de cette variante est répertorié dans la base de données des mutations de l’ALD. L’ensemble de ces éléments a permis de poser avec certitude le diagnostic d’AMN. Notre proband présentait des symptômes typiques de l’AMN, mais la variabilité phénotypique inhérente à ABCD1 pourrait entraîner une présentation différente de l’X-ALD pour d’autres individus possédant cette variante.
Abréviations
| ABCD1: | Cassette de liaison à l’ATP, sous-famille D, membre 1 (gène) |
| VLCFA : | Acides gras à très longue chaîne |
| X-ALD: | Adrénoleucodystrophie liée à l’X |
| AMN: | Adrénomyéloneuropathie. |
Data Availability
Les ensembles de données et le matériel sont détaillés dans le manuscrit.
Consentement
Toutes les procédures suivies étaient conformes aux normes éthiques du comité responsable de l’expérimentation humaine (institutionnel et national) et à la déclaration d’Helsinki de 1975, telle que révisée en 2000 (5). Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients pour être inclus dans l’étude.
Conflits d’intérêts
Tous les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts.
Contributions des auteurs
Tous les auteurs ci-dessus ont contribué de manière substantielle à la conception ou au design du travail ; ou à l’acquisition, l’analyse ou l’interprétation des données pour le travail ET à la rédaction du travail ou à sa révision critique pour un consentement intellectuel important ET ont donné l’approbation finale de la version à publier ET ont accepté d’être responsables de tous les aspects du travail en s’assurant que les questions liées à l’exactitude ou à l’intégrité de toute partie du travail sont examinées et résolues de manière appropriée.
Financement
Le financement a été assuré par le Center for Individualized Medicine, Mayo Clinic qui a fourni des fonds pour réaliser cette étude.
Reconnaissance
TC remercie le Center for Individualized Medicine de la Mayo Clinic Jacksonville pour le soutien à la recherche.