Deux résidus d’acides aminés déterminent la sensibilité au 2-APB des canaux ioniques TRPV3 et TRPV4

Résultats

Identification des mutations affectant spécifiquement les réponses au 2-APB.

Nous avons criblé une bibliothèque de mutants TRPV3 de souris composée de ≈14 000 constructions d’ADNc portant en moyenne 2,5 mutations par clone générées par PCR à risque d’erreur. Les constructions mutantes ont été transfectées dans des cellules de rein embryonnaire humain (HEK293), et les réponses calciques évoquées par la chaleur (42 °C), 25 μM de 2-APB et 1,75 mM de camphre ont été suivies dans un lecteur de plaques à imagerie de fluorescence (FLIPR). Nous avons récemment décrit l’identification des résidus spécifiquement requis pour l’activation thermique de TRPV3 (20). Ici, nous nous sommes concentrés sur l’ensemble de données du 2-APB et du camphre pour identifier les résidus spécifiquement requis pour les réponses chimiques.

Spécifiquement, nous avons sélectionné les clones qui ont montré des réponses normales pour un produit chimique, mais une activation significativement réduite par l’autre (pour les critères de sélection, voir Méthodes). Les clones positifs ont été prélevés, repoussés, et les courbes dose-réponse complètes contre chaque stimulus ont été mesurées, et les valeurs EC50 calculées (voir Méthodes). Sept clones mutants ont été confirmés comme étant spécifiquement déficients en 2-APB, et séquencés. De façon remarquable, tous les 7 clones comprenaient des mutations dans 1 des 2 résidus. Le premier, l’histidine (H) 426, est présent dans la région cytoplasmique N-terminale, entre les domaines ankyrine et transmembranaire. Nous avons identifié 4 substitutions distinctes de H426 dans le crible (Tableau 1). La seconde, l’arginine (R) 696 est présente dans la boîte TRP cytoplasmique C-terminale (IWRLQR), un domaine conservé dans les canaux TRP (2, 3). Les 3 mutations au niveau de ce résidu présentent la même substitution d’arginine en lysine, étroitement liée. Les 7 mutations ont provoqué de graves déficits dans les réponses au 2-APB, sans affecter les réponses au camphre (tableau 1). Bien que certains clones déficients en camphre aient également été identifiés, il s’agissait de mutations relativement plus subtiles, déplaçant les valeurs de la CE50 du camphre ≈2 fois ou moins (données non présentées). Pour cette raison, nous avons concentré cette étude sur les 2 résidus causant spécifiquement >10 fois la déficience en 2-APB.

Caractérisation électrophysiologique initiale des canaux TRPV3-H426 et TRPV3-R696.

La FLIPR est un moyen indirect de mesurer l’activité des canaux ioniques. Pour confirmer nos résultats de FLIPR, nous avons utilisé la technique de patch clamp et mesuré les courants de cellules entières de TRPV3, TRPV3-H426N et TRPV3-R696K de souris de type sauvage lorsque le 2-APB (1 μM à 3 mM) ou le camphre (0,3 à 20 mM) étaient appliqués individuellement dans le bain, de faibles à fortes concentrations (figure 1 et figure S1). De manière concentration-dépendante, le 2-APB a activé les courants dans les cellules HEK293 transfectées avec le TRPV3 de type sauvage avec des valeurs moyennes de CE50 de 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) et 36,8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) à +100 et -100 mV, respectivement (Fig. 1A ; Fig. S1A) ; le 2-APB n’a pas induit de courants mesurables dans les cellules HEK293 transfectées avec TRPV3-H426N jusqu’à 100 μM. Cependant, les concentrations de 2-APB qui sont saturantes pour le TRPV3 de type sauvage (0,3 à 3 mM) étaient capables d’activer les courants dans ce mutant de manière concentration-dépendante (figure 1A ; figure S1A). Par conséquent, le TRPV3-H426N a montré un décalage de la CE50 de >10 fois de l’activation dépendante du 2-APB, et la réponse n’a jamais atteint la saturation. Dans des expériences parallèles, le camphre a également activé les courants dans les cellules HEK293 transfectées avec le TRPV3 de type sauvage d’une manière dépendante de la concentration avec des valeurs de CE50 de 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) et 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) à +100 et -100 mV, respectivement. De manière importante, des réponses de type sauvage au camphre ont été observées dans les cellules HEK293 transfectées avec le TRPV3-H426N , confirmant que l’activation du camphre n’est pas altérée dans ce mutant (Fig. 1A ; Fig. S1B).

Dans les expériences de patch-clamp sur cellules entières, le 2-APB a également induit une activation minimale du TRPV3-R696K. À +100 mV, le 2-APB a commencé à activer les cellules HEK293 exprimant ce canal mutant à ≈3 μM, et a atteint la saturation à 30 μM, avec une CE50 de 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Des concentrations plus élevées de 2-APB (>30 μM) ont évoqué un courant de désensibilisation avec une  » off-response  » après le lavage du 2-APB, un phénomène qui est décrit en détail ci-dessous. Cependant, à -100 mV, le 2-APB n’a pas réussi à activer les canaux mutants R696K même à 1 mM (Fig. 1B ; Fig. S1A). La réponse maximale au 2-APB à 1 mM à -100 mV était de -2,3 ± 1,4 pA/pF (n = 6), ce qui est significativement plus faible (>10 fois) que pour les canaux TRPV3 de type sauvage (-482,1 ± 69,2 pA/pF à 300 μM, n = 17), ce qui suggère que la réponse maximale du canal évoquée par le 2-APB est diminuée chez le mutant TRPV3-R696K. Cependant, le camphre a activé des réponses similaires aux cellules HEK293 transfectées par TRPV3 et TRPV3-R696K (figure 1B ; figure S1B). Par conséquent, les données électrophysiologiques initiales ont confirmé nos résultats de criblage selon lesquels les mutants TRPV3-H426N et TRPV3-R696K sont déficients dans la réactivité au 2-APB, sans affecter la fonction globale du canal comme testé par leur capacité à répondre au camphre.

Nous avons ensuite demandé quelles propriétés de la chaîne latérale de H426 et R696 sont cruciales pour l’activation de TRPV3 par le 2-APB. Nous avons muté individuellement les positions 426 et 696 en tous les autres acides aminés et mesuré les courbes dose-réponse de la FLIPR pour le 2-APB et le camphre. Il est intéressant de noter que tous les mutants H426 ont présenté une diminution des réponses au 2-APB avec une forte augmentation (>10 fois) des valeurs EC50 (Tableau S1). La plupart des mutants avaient des réponses normales au camphre, à l’exception de la substitution de proline cassant l’hélice, qui a montré une augmentation ≈2 fois de la CE50 du camphre. Ces données sont cohérentes avec le résultat de notre crible primaire qui a identifié 4 substitutions différentes entraînant une déficience en 2-APB à cette position. Les canaux mutants portant des chaînes latérales aromatiques F, T et W n’ont répondu ni au camphre ni au 2-APB. Cependant, la plupart des mutants R696 ont montré des réponses réduites au 2-APB, mais avaient également des réponses maximales réduites au camphre (20 mM), indiquant que ces mutations affectent l’expression ou la fonction globale du canal (Tableau S2). Ce résultat est également cohérent avec notre résultat initial du crible primaire, où seule la substitution de lysine a été identifiée comme étant spécifiquement requise pour le 2-APB à ce résidu. R696F a également montré un certain déficit spécifique au 2-APB, bien que les réponses maximales au camphre aient été légèrement affectées. Les mutants R696D, R696G, R696N, R696P, R696S et R696T n’ont pas montré de réponses significatives au 2-APB ou au camphre lorsqu’ils ont été comparés aux cellules transfectées par le vecteur pcDNA.

La réponse dépendante de la tension est restée intacte dans les mutants 2-APB.

La dépendance de la tension a été montrée comme ayant des rôles importants dans l’activation et la porte du canal TRP (1, 10-12, 21). En l’absence de stimulateurs chimiques (par exemple le camphre ou le 2-APB), les étapes de tension de -120 à +180 mV (étape de 20 mV) n’ont pas activé les courants dans les cellules HEK293 transfectées avec le TRPV3 de type sauvage, ce qui indique que le TRPV3 (contrairement au TRPV1 et au TRPM8) n’est pas activé par la tension seule à la gamme testée ici (20, 22). Cependant, en présence de 30 μM de 2-APB, un courant dépendant du voltage a été activé (figure S2A). Comme prévu, aucun courant détectable modulé par le voltage n’a été observé dans TRPV3-H426N lorsqu’il a été traité avec 30 μM de 2-APB (Fig. S2B). Cependant, le camphre 6 mM a évoqué un courant dépendant du voltage dans les cellules HEK293 exprimant le TRPV3 de type sauvage (V1/2 de 81,3 ± 2,6 mV) (Fig. S2 A et D) et le TRPV3-H426N (V1/2 de 81,3 ± 2,5 mV) (Fig. S2 B et D). Comme pour TRPV3-H426N, il n’y avait pas de courant détectable modulé par le voltage dans TRPV3-R696K lorsqu’il était traité avec 30 μM de 2-APB (Fig. S2C). Cependant, le camphre a activé un courant dépendant du voltage avec un V1/2 de 81,1 ± 5,4 mV (Fig. S2 C et D). Ces résultats indiquent que la modulation de tension est intacte dans TRPV3-H426N et TRPV3-R696K, et implique que la perte de tension-dépendance n’est probablement pas la cause de la diminution des réponses au 2-APB dans ces canaux mutants.

Sensibilité à la température de TRPV3-H426N et TRPV3-R696K.

La sensibilité à la température est une caractéristique de la fonction du canal TRPV3 (14, 16, 23). Par conséquent, nous avons demandé si l’activation par la température était altérée dans les clones TRPV3-H426N et TRPV3-R696K. Nous avons mesuré l’activation par la température (25 à 42 °C) des cellules HEK293 transfectées avec le TRPV3 de type sauvage, le TRPV3-H426N, ou le mutant TRPV3-R696K dans un test FLIPR. Les réponses à la chaleur de TRPV3-H426N étaient soit égales soit légèrement supérieures aux réponses de TRPV3 de type sauvage (n = 4 expériences), ce qui suggère que l’activation par le 2-APB et la chaleur peuvent être séparées (Fig. S2E ; et données non présentées). Cependant, les réponses à la chaleur dans TRPV3-R696K étaient beaucoup plus petites par rapport au type sauvage (n = 3 expériences), ce qui suggère que ce mutant ne modifie pas spécifiquement l’activation 2-APB (Fig. S2E).

Dépendance du calcium désensibilisation de TRPV3-R696K.

Une caractéristique intéressante de la réponse au 2-APB dans les cellules HEK293 transfectées par TRPV3-R696K est une désensibilisation rapide à >30 μM de 2-APB et une off-response au 2-APB à des concentrations élevées (Fig. S3). Ce phénomène est en contraste avec le TRPV3 de type sauvage, qui se sensibilise en réponse à une stimulation répétitive/continue de produits chimiques ou de chaleur (14, 16). Le mécanisme sous-jacent à la sensibilisation de TRPV3 est proposé comme étant une perte d’inhibition du calcium de ce canal (22). Comme la désensibilisation de la plupart des autres canaux TRP (tels que TRPV1 et TRPA1) à des stimuli chimiques ou thermiques dépend également du calcium extracellulaire (24, 25), nous avons cherché à vérifier si le calcium extracellulaire joue un rôle dans les réponses de désensibilisation provoquées par le 2-APB dans TRVP3-R696K. De manière surprenante, en l’absence de calcium extracellulaire, 100 μM de 2-APB ont activé un courant entrant et sortant robuste, de type sauvage, dans TRPV3-R696K (densité de courant de TRPV3-R696K : 755.7 ± 200,0 pA/pF à +100 mV, -641,2 ± 133,9 pA/pF à -100 mV (n = 5) ; TRPV3 de type sauvage : 615,0 ± 266,7 pA/pF à +100 mV, et -471,0 ± 83,2 pA/pF à -100 mV, n = 9) (Fig. S4 A et B). Ce résultat suggère que le remplacement d’une arginine par une lysine en position 696 dans la boîte TRP de TRPV3 fait passer le canal dans un état de désensibilisation lors de la stimulation par le 2-APB mais pas par le camphre, d’une manière dépendante du calcium. Un résidu putatif de liaison au Ca2+ dans le domaine de la boucle du pore, l’aspartate 641, est conservé parmi tous les canaux TRPV, et est critique pour les propriétés de perméation des canaux TRP (26, 27). Il a été démontré que la mutation de D641 en asparagine (N) réduit le blocage par le rouge de ruthénium et l’inhibition calcique extracelullaire de haute affinité de TRPV3 et d’autres canaux TRP (17, 22, 26, 27). Par conséquent, nous avons examiné si la mutation D641N pouvait soulager le clone TRPV3-R696K de la perte de la réponse 2-APB dépendante du calcium. Dans un essai FLIPR, le TRPV3-D641N avait une EC50 de 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), ce qui représente environ la moitié de la valeur du TRPV3 de type sauvage (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). Le double mutant TRVP3-D641N/R696K a présenté une EC50 de 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), ce qui montre que la mutation D641N a entièrement restauré la réponse au 2-APB du TRPV3-R696K. Comme prévu, la réponse au camphre était similaire entre TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N et TRPV3-D641N/R696K (Fig. S4 C et D). Ces études démontrent que TRPV3-R696 n’est pas purement une mutation 2-APB. Les déficits observés sont médiés par le calcium, affectant les réponses au 2-APB mais pas au camphre.

La sensibilité au 2-APB chez les orthologues de TRPV3.

Les conservations d’acides aminés et les variations entre orthologues sont des outils utiles pour disséquer les relations structure-fonction des protéines, y compris les canaux TRP (28, 29). Par conséquent, nous avons demandé si ces orthologues de TRPV3 ont des réponses comparables au camphre et au 2-APB. En effet, les canaux TRPV3 de l’homme, du chien et de la grenouille, qui ont des histidines à la position 426 équivalente à celle de la souris (Fig. 2A), ont des réponses au 2-APB similaires lorsqu’ils sont surexprimés dans des cellules HEK293 (bien que les réponses au camphre dans le TRPV3 de Xenopus tropicalis aient été diminuées par rapport au TRPV3 de souris de type sauvage) (Fig. 2C). Comme prévu, lorsque H426 chez l’homme, le chien et la grenouille a été muté en N, les courbes de réponse à la concentration de 2-APB ont été fortement déplacées vers la droite dans chacun de ces orthologues de TRPV3 (Fig. 2B). Là encore, cette mutation n’a pas diminué la sensibilité au camphre par rapport aux orthologues TRPV3 de type sauvage (Fig. 2C). Au contraire, les mutants TRPV3 H426N de l’homme et de la grenouille avaient une sensibilité au camphre légèrement supérieure à celle de leurs homologues de type sauvage. Ces résultats indiquent que le mécanisme d’activation du TRPV3 par le 2-APB pourrait être conservé chez différentes espèces.

Intéressant, bien que R696 soit conservé dans la boîte TRP de TRPV3 parmi toutes les espèces, la position équivalente à la souris 426 dans TRPV3 de poulet (cTRPV3) est un N (427). Comme montré ci-dessus, une substitution H-N au résidu 426 chez les espèces de mammifères ou d’amphibiens interfère avec les réponses appropriées au 2-APB (Fig. 2A). Conformément au fait que ce résidu est important pour les réponses au 2-APB, la CE50 du 2-APB dans le cTRPV3 est de 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) par rapport à celle de 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) pour le TRPV3 de la souris. De manière frappante, la mutation de N427 en H a déplacé la courbe concentration-réponse du 2-APB de manière significative vers la gauche (EC50 de 6,1 ± 0,9 μM, nHill = 2,3), tout en laissant la valeur de l’EC50 pour le camphre inchangée (figure 3A). L’enregistrement par patch clamp de cellules entières a confirmé que la courbe concentration-réponse au 2-APB était fortement décalée vers la gauche chez le poulet TRPV3-N427H par rapport au cTRPV3 de type sauvage à la fois à +100 et -100 mV (Fig. 3B). Les enregistrements monocanaux ont révélé une augmentation de près de 200 fois des ouvertures de canaux par rapport au niveau basal par 25 μM de 2-APB dans les patchs inside-out des cellules exprimant cTRPV3-N427H (n = 7), alors qu’aucun changement significatif n’a été observé dans les patchs inside-out des cellules HEK293 exprimant cTRPV3 de type sauvage (n = 5). Cependant, 6 mM de camphre a fortement augmenté les ouvertures de canal unique dans les patches inside-out de cellules HEK293 transfectées avec soit le cTRPV3 de type sauvage ou le mutant cTRPV3-N427H à des niveaux similaires (Fig. 3 C-E). Par conséquent, une seule mutation ponctuelle dans le TRPV3 de poulet augmente spécifiquement sa sensibilité au 2-APB.

La sensibilité au 2-APB dans les thermoTRP apparentés : TRPV1, TRPV2, et TRPV4.

Le TRPV3 des mammifères est étroitement lié au TRPV1 (39% d’homologie d’acides aminés), au TRPV2 (36% d’homologie), et au TRPV4 (38% d’homologie). De manière intéressante, le 2-APB est un agoniste commun de TRPV1, TRPV2, et TRPV3, mais pas de TRPV4 (18). Par conséquent, nous avons demandé si un mécanisme commun existe pour l’action du 2-APB sur ces canaux ioniques apparentés. La position équivalente de l’His-426 du TRPV3 de la souris est N dans le TRPV1 (N419), TRPV2 (N379), et TRPV4 (N456) (Fig. 4A ; Fig. S5A). La position équivalente du R696 de la souris TRPV3 dans la boîte TRP est également R (R701) dans TRPV1, une lysine conservée (K664) dans TRPV2, et un tryptophane non chargé (W737) dans TRPV4 (Fig. 4A ; Fig. S5A).

Nous nous sommes concentrés sur le résidu H N-terminal, qui est spécifiquement requis pour des réponses 2-APB correctes pour le TRPV3 des mammifères et des amphibiens, et une mutation N vers H au niveau de ce résidu est suffisante pour induire des réponses 2-APB robustes dans le TRPV3 du poulet. Les TRPV1 et TRPV2 de type sauvage portent des N à la position équivalente de TRPV3 H426, mais montrent des réponses robustes au 2-APB. Ce résultat soulève la possibilité que TRPV1 et TRPV2 répondent au 2-APB par des mécanismes distincts par rapport à TRPV3. Néanmoins, nous avons testé si l’introduction d’un H à cette position affecte spécifiquement les réponses au 2-APB dans TRPV2 et TRPV1. Le mutant TRPV1-N419H a présenté des réponses accrues à la fois au 2-APB et à la capsaïcine, indiquant un effet non spécifique sur l’expression ou la fonction du canal (Fig. S5B). Le mutant TRPV2-N379H correspondant avait des réponses similaires au 2-APB et au probénécide (un autre agoniste de TRPV2) par rapport au TRPV2 de type sauvage (Fig. S5C) (30). Ces résultats suggèrent que le mécanisme d’activation du 2-APB de TRPV2 et TRPV1 n’est pas complètement conservé avec celui de TRPV3 (voir Discussion).

Nous avons ensuite demandé si les résidus équivalents de TRPV3-H426 et R696 sont responsables de l’absence de réponses au 2-APB dans TRPV4. Pour répondre à cette question, nous avons muté les résidus d’acides aminés équivalents à N456 et W737 dans TRPV4 en H et R, respectivement (Fig. 4A). Les TRPV4 de type sauvage et les TRPV4-W737R n’ont montré que des réponses marginales au 2-APB par rapport aux contrôles transfectés par le vecteur (Fig. 4B). Cependant, de façon remarquable, les cellules HEK293 transfectées avec TRPV4-N456H ont répondu au 2-APB avec une CE50 de 131,0 ± 3,3 μM (nHill = 2,4). De plus, le TRPV4 portant les doubles mutations N456H/W737R a montré des réponses encore plus robustes au 2-APB, avec une EC50 de 10,0 ± 0,8 μM (nHill = 1,2) (proche de la valeur du TRPV3 de souris de type sauvage) (figure 4B). Les réponses à l’agoniste TRPV4 4-α-PDD n’étaient pas significativement différentes entre le TRPV4 de type sauvage et tous les mutants TRPV4, ce qui suggère que l’augmentation des réponses au 2-APB n’est pas due à une augmentation du niveau d’expression du TRPV4 ou à un gain global de fonction (Fig. 4B). Les enregistrements dans des patchs excisés inside-out exprimant TRPV4, TRPV4-N456H, TRPV4-W737R, ou TRPV4-N456H/W737R ont révélé une activité monocanal par 150 μM de 2-APB à la fois dans TRPV4-N456H et TRPV4-N456H/W737R, ce dernier présentant des réponses plus robustes (Fig. S6 B et C). Aucune activité de canal unique activée par le 2-APB n’a été observée dans les TRPV4 de type sauvage et les TRPV4-W737R (Fig. S6A ; et données non présentées). Ces résultats indiquent que les différences au niveau des 2 résidus d’acides aminés identifiés dans notre criblage sont responsables du manque de sensibilité au 2-APB de TRPV4.