Bien que les dosages protéiques aient une variété d’utilisations dans la recherche en sciences de la vie, il n’existe pas de méthode de dosage unique qui convienne à toutes les applications. Malgré toutes les avancées de la science moderne, il n’existe pas de méthode de dosage des protéines qui ne soit pas affectée par les composants non protéiques ou par les différences de composition des protéines. Pour cette raison, les laboratoires de protéines trouvent nécessaire de disposer de plus d’un type de dosage des protéines pour les applications de recherche.
Chaque dosage a ses propres avantages et limites. Ainsi, si vous voulez obtenir des résultats précis de votre expérience, vous devez être en mesure de sélectionner le dosage le plus approprié pour votre application.
Types de dosage colorimétrique des protéines
Selon la chimie impliquée, les deux méthodes les plus courantes pour la détection colorimétrique et la quantification des protéines totales sont le dosage de liaison protéine-colorant et/ou le dosage de chélation à base d’ions cuivre.
Tests de liaison de colorant
Les tests de liaison de colorant, tels que les tests de protéine de Bradford (Coomassie) et 660nm, sont basés sur la liaison des molécules de protéines au colorant de Coomassie dans des conditions acides. Une fois que les molécules de protéines se lient au colorant, la couleur passe du brun (Amax= 465nm) au bleu (Amax= 610nm). Le changement de densité de couleur (qui se lit à 595nm) est proportionnel à la concentration en protéines.
Les acides aminés basiques (arginine, lysine et histidine) jouent un rôle essentiel dans la formation des complexes colorant-protéine et le décalage spectral qui en résulte, tandis que les protéines plus petites (moins de 3kDa) et les acides aminés ne produisent pas de changements de couleur.
Tests à base d’ions cuivre
Dans les tests protéiques à base d’ions cuivre, la solution protéique est mélangée avec une solution alcaline de sel de cuivre pour faciliter la chélation des ions cuivriques (Cu2+) avec les liaisons peptidiques, et la réduction ultérieure des ions cuivriques (Cu2+) en ions cuivreux (Cu+). Tout excès d’ions cuivreux restera non lié aux liaisons peptidiques et sera disponible pour la détection.
Les dosages protéiques basés sur les ions cuivreux peuvent être divisés en deux groupes – (1) les dosages qui détectent les ions cuivreux réduits (Cu+) et (2) les dosages qui détectent les ions cuivriques (Cu2+) non liés. L’acide bicinchoninique (BCA) ou le réactif de Folin (acide phosphomolybdique/phosphotungstique) peuvent être utilisés pour détecter les ions cuivreux. Lors de la réduction du réactif utilisé, une couleur bleue est produite. La quantité de couleur produite peut être lue à 650nm à 750nm et est proportionnelle à la quantité de liaisons peptidiques.
Note : La présence de tyrosine, de tryptophane, de cystéine, d’histidine et d’asparginine dans les protéines augmente la densité de couleur résultante.
Dans les essais basés sur la détection des ions cuivriques non liés, du cuivre alcalin est mélangé à la solution protéique et les ions cuivriques non liés sont ensuite détectés avec un réactif produisant une couleur qui réagit avec les ions cuivriques. La quantité de couleur produite est inversement proportionnelle à la quantité de liaison peptidique dans l’échantillon.
Sélectionner les essais protéiques : Quelques facteurs à prendre en compte
Il y a un certain nombre de facteurs que vous devez prendre en compte lorsque vous choisissez un dosage. En voici quelques-uns.
- Compatibilité avec le type d’échantillon et les composants. La nature de l’échantillon de protéines et la présence d’agents non protéiques dans les solutions protéiques peuvent affecter de manière significative les résultats de votre expérience. Gardez à l’esprit que la présence d’agents réducteurs, d’agents chélateurs de métaux, de colorants, d’amines et de sucres interfère avec les dosages protéiques à base de cuivre tandis que les solutions protéiques contenant des détergents interfèrent avec les dosages protéiques à base de colorants.
- Plage de dosage et volume d’échantillon requis. La plupart des dosages colorimétriques nécessitent au moins 0,5µg de protéines pour une estimation fiable. Ainsi, pour les échantillons difficiles à obtenir, les méthodes qui nécessitent la plus petite quantité d’échantillon pour une estimation fiable doivent être envisagées.
- Uniformité protéine à protéine. Les dosages de protéines à base de colorants et ceux qui impliquent la réduction des ions cuivreux en ions cuivriques présentent une variation significative de protéine à protéine.
- Considérations de temps. La complexité de l’échantillon et la méthode de dosage choisie dictent le temps dont vous avez besoin pour effectuer votre dosage de protéines. Les échantillons de protéines contenant des agents interférents et les dosages qui utilisent des tracés ou des courbes standard consommeront plus de temps.
- Exigences en matière d’instrumentation. La disponibilité d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de plaque nécessaire pour mesurer la couleur produite (absorbance) par l’essai peut également affecter votre choix.
