Etudes de stabilité du thiocolchicoside en vrac et en capsules à l’aide de la RP-HPTLC/Densitométrie

Certaines méthodes analytiques, telles que la LC-ESI-MS RP-HPLC et l’UV-Spectrophotométrique ont été établies pour la détermination du thiocolchicoside seul dans les formulations en vrac et pharmaceutiques.

Le thiocolchicoside est disponible en combinaison avec de nombreux autres médicaments ; par conséquent, plusieurs méthodes telles que les méthodes UV-Spectrophotométrique , RP-HPLC , et HPTLC ont été étudiées pour la détermination du thiocolchicoside dans les formes de dosage combinées.

Les directives de la Conférence internationale sur l’harmonisation (ICH) intitulées « Essais de stabilité des nouveaux produits et substances pharmaceutiques » exigent que des essais sous contrainte puissent être effectués pour élucider les caractéristiques de stabilité inhérentes à la substance active. Une méthode idéale d’indication de la stabilité est celle qui résout le médicament standard ainsi que ses produits de dégradation . Il est donc nécessaire de développer une méthode de détermination fiable et rapide, qui pourrait également être utilisée pour obtenir la séparation optimale des composants de dégradation du composé parent. Cependant, à notre connaissance, aucun article relatif à la détermination par RP-HPTLC du thiocolchicoside indiquant la stabilité n’a jamais été mentionné dans la littérature. L’objectif du travail décrit dans cet article est d’établir les conditions d’identification et d’analyse quantitative du thiocolchicoside en présence de ses produits de dégradation pour évaluer la pureté du médicament en vrac et la stabilité de ses formes galéniques. L’adéquation de la méthode RP-HPTLC indicatrice de stabilité pour la détermination quantitative du thiocolchicoside a été prouvée par la validation conformément à l’exigence des directives ICH .

2. expérimentale

2.1. Produits chimiques et réactifs

Le thiocolchicoside a été obtenu comme un échantillon cadeau de Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, Inde. Le méthanol de qualité HPLC, HCl, NaOH et H2O2 ont été achetés auprès de Merck Chemicals, Inde.

2.2. Instrumentation HPTLC

La norme de médicament et les échantillons ont été repérés sous forme de bandes de 6 mm de largeur avec une seringue microlitre CAMAG Linomat (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Suisse) en utilisant un applicateur de 5 échantillons CAMAG Linomat (CAMAG Muttenz, Suisse) avec un taux d’application constant, 150 nL par seconde. Les plaques ont été prélavées avec du méthanol et activées à 100°C pendant 10 minutes avant la chromatographie. La chromatographie a été réalisée sur des plaques d’aluminium prérevêtues de gel de silice 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Allemagne). Le développement linéaire ascendant avec du méthanol : eau (70 : 30 v/v) comme phase mobile a été réalisé dans une chambre en verre à double auge de 20 × 10 cm (CAMAG Muttenz, Suisse). Le temps de saturation optimisé de la chambre pour la phase mobile était de 30 minutes à température ambiante (28 ± 2°C). La longueur du chromatogramme était d’environ 80 mm. Le temps de développement de la plaque était de 25 min. Après développement, les plaques ont été séchées dans un courant d’air par un séchoir à air. La détection des taches a ensuite été effectuée à 377 nm avec un CAMAG TLC Scanner 3 en mode absorbance opéré par le logiciel winCATS version 1.3.0. La source de rayonnement était une lampe au deutérium. Les dimensions de la fente étaient de 6 mm × 0,45 mm, et la vitesse de balayage, de 20 mm par seconde.

2.3. Préparation du stock standard

Solution standard stock de 1 mg/mL de thiocolchicoside dans le méthanol.

2.4. Étude de linéarité

La solution standard stock dans la gamme de 0,2 à 1,2 mL a été transférée dans six fioles volumétriques séparées de 10 mL, et le volume a été complété avec du méthanol. À partir de chacune des solutions ci-dessus, 5 μL ont été appliqués sur des plaques RP-HPTLC pour obtenir une concentration dans la gamme de 100 à 600 ng par bande. La courbe d’étalonnage de la méthode a été construite comme la surface du pic en fonction de la concentration du médicament.

2.5. Préparation de la solution d’échantillon

Pour déterminer la teneur en thiocolchicoside dans la capsule, vingt capsules (MYORIL, allégation de l’étiquette : 8 mg de thiocolchicoside par capsule) ont été pesées ; le contenu des capsules a été retiré ; et le poids moyen a été déterminé. Une quantité équivalente à 8 mg de thiocolchicoside a été transférée dans une fiole jaugée de 100 mL contenant 50 mL de méthanol et soniquée pendant 10 minutes ; le volume a été ajusté au trait et filtré à l’aide du papier filtre Whatmann No. 41. Un volume de 5 mL a été dilué à 10 mL avec du méthanol ; la solution résultante de 5 μL a été appliquée sur une plaque RP-HPTLC pour le dosage du thiocolchicoside. Les plaques ont été développées et scannées comme décrit ci-dessus.

2.6. Validation de la méthode

La méthode a été validée pour les paramètres suivants conformément aux directives de l’ICH.

2.6.1. Précision

La répétabilité de l’application de l’échantillon et la mesure de la surface du pic ont été effectuées en utilisant six répétitions de la concentration d’essai (400 ng par bande de thiocolchicoside). La variation intra- et inter-journalière pour l’estimation du thiocolchicoside a été réalisée en utilisant trois réplicats à trois niveaux de concentration différents (200, 300 et 500 ng par bande).

2.6.2. Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)

Afin de déterminer la limite de détection et de quantification, des concentrations de thiocolchicoside dans la partie inférieure de la gamme linéaire de la courbe d’étalonnage ont été utilisées. A partir de la solution standard stock, 100, 120, 140, 160, 180 et 200 ng de thiocolchicoside par bande ont été appliqués en triplicatas sur une plaque RP-HPTLC et la LOD et la LOQ ont été calculées à l’aide des équations suivantes : où «  » est l’écart-type des surfaces des pics des médicaments (), pris comme mesure du bruit et «  » est la pente de la courbe d’étalonnage correspondante.

2.6.3. Spécificité

La spécificité de la méthode a été vérifiée en analysant l’étalon de médicament et l’échantillon. La bande du thiocolchicoside dans l’échantillon a été confirmée en comparant les valeurs et les spectres de la bande avec ceux du standard de médicament. La pureté du pic du thiocolchicoside a été confirmée en comparant les spectres à trois niveaux différents, c’est-à-dire les positions pic-début (), pic-apex () et pic-fin () de la bande.

2.6.4. Robustesse

La robustesse de la méthode a été réalisée en analysant 400 ng de thiocolchicoside par deux analystes différents gardant les mêmes conditions expérimentales et environnementales.

2.6.5. Précision

Neuf bandes de solution d’échantillon de thiocolchicoside (200 ng par bande) ont été appliquées sur la plaque, puis la quantité connue de thiocolchicoside a été appliquée en trois exemplaires à 80, 100 et 120 % (160, 200 et 240 ng par bande) de la concentration de l’échantillon (200 ng par bande) et réanalysée par la méthode proposée. Ceci a été réalisé pour évaluer l’étude de récupération du médicament à différents niveaux dans les formulations.

2.6.6. Robustesse

En apportant de petites modifications la composition de la phase mobile, la quantité de phase mobile, le temps de l’application au développement, et le temps du développement à la numérisation, les effets sur les résultats ont été examinés. Des phases mobiles ayant différentes compositions de méthanol : eau (72 : 28 v/v) et méthanol : eau (68 : 32 v/v) ont été essayées et des chromatogrammes ont été réalisés. Les plaques ont été prélavées au méthanol et activées à 80 ± 5°C pendant 2, 5 et 8 minutes avant la chromatographie. La robustesse de la méthode a été réalisée en utilisant six répliques du même spot (400 ng par bande de thiocolchicoside).

2.7. Dégradation forcée du thiocolchicoside

2.7.1. Hydrolyse acide et basique

Une quantité de 10 mg de thiocolochicoside, pesée avec précision, a été dissoute séparément dans 10 mL de solution méthanolique de HCl 1,0 M et de NaOH 0,5 M, respectivement, et portée à reflux pendant 30 min à 60°C dans l’obscurité pour éviter l’effet dégradant probable de la lumière. Un volume de 1,0 ml des solutions ci-dessus a été prélevé séparément, neutralisé et dilué jusqu’à 10 ml avec du méthanol. Les solutions résultantes ont été appliquées sur les plaques RP-HPTLC en triplicata (5 μL chacune, soit 500 ng par bande). Les chromatogrammes ont été développés et scannés comme décrit ci-dessus.

2.7.2. Dégradation oxydative

Pour la dégradation oxydative, une quantité exactement pesée de 10 mg de thioclochicoside a été dissoute séparément dans 10 mL de solution méthanolique de 1% v/v de H2O2 et 3% v/v de H2O2, respectivement, et maintenue dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Après 30 minutes, 1,0 ml de chacune des solutions ci-dessus a été prélevé et dilué jusqu’à 10 ml avec du méthanol. Les solutions résultantes ont été appliquées sur des plaques RP-HPTLC en triplicata (5 μL chacune, soit 500 ng par bande). Les chromatogrammes ont été développés et scannés comme décrit ci-dessus.

2.7.3. Dégradation par la chaleur sèche

Une quantité de 10 mg de thiocolchicoside, pesée avec précision, a été stockée à 70°C pendant 8 h dans un four. Elle a été transférée dans une fiole jaugée de 10 mL contenant du méthanol et le volume a été complété jusqu’à la marque. On a prélevé 1,0 ml de la solution ci-dessus et on l’a diluée jusqu’à 10 ml avec du méthanol. La solution résultante a été appliquée sur la plaque RP-HPTLC en triplicata (5 μL chacun, soit 500 ng par bande). Le chromatogramme a été développé et scanné comme décrit ci-dessus.

2.7.4. Photo Dégradation

Une quantité de 10 mg de thiocolchicoside, pesée avec précision, a été dissoute dans 10 mL de méthanol et les solutions ont été conservées pendant une période de 24 h à la lumière. Un volume approprié de 1,0 ml de la solution ci-dessus a été prélevé et dilué jusqu’à 10 ml avec du méthanol. La solution résultante a été appliquée sur une plaque RP-HPTLC en triplicata (5 μL chacun, soit 500 ng par bande). Le chromatogramme a été développé et scanné comme décrit ci-dessus.

3. Résultats et discussion

3.1. Développement de la phase mobile optimale

Pour la sélection de la phase mobile appropriée pour la séparation du thiocolchicoside, plusieurs passages ont été exercés en utilisant des phases mobiles contenant des solvants de polarités variables, à différents niveaux de concentration. Parmi les différentes combinaisons de phases mobiles employées, la phase mobile constituée de méthanol : eau (70 : 30 v/v) a donné un pic net et bien défini à la valeur de 0,60 ± 0,02 (figure 2). Les bandes bien distinctes ont été trouvées lorsque la chambre a été saturée avec la phase mobile pendant 30 min à température ambiante.

Figure 2

Chromatogramme du standard de thiocolchicoside avec ( 0,60 ± 0,02) à 377 nm dans du méthanol : eau (70 : 30 v/v) comme phase mobile.

3.2. Courbe d’étalonnage

Les données de régression linéaire des courbes d’étalonnage () ont montré une bonne relation linéaire sur la gamme de concentration de 100 à 600 ng par bande. L’équation de régression linéaire a été trouvée comme étant , = 0,9984 (Figure 3).

Figure 3

Courbe d’étalonnage du thiocolchicoside (100-600 ng par bande).

3.3. Validation de la méthode

La méthode développée a été validée selon les directives de l’ICH.

La précision de la méthode a été révélée en termes de % d’écart-type relatif (% RSD) de la surface du pic. Les résultats (tableau 1) ont mis en évidence la précision des sons de la méthode qui ont été déterminés à partir de la pente de la partie la plus basse de la courbe d’étalonnage. Le LOD et LOQ ont été trouvés à 9,77 ng et 29,63 ng, respectivement, ce qui indique la sensibilité de la méthode, est adéquate.

Les études de récupération ont été exécutées à 80 %, 100 % et 120 % de la concentration testée, conformément aux directives de l’ICH. Le % de récupération du thiocolchicoside aux trois niveaux a été trouvé dans la gamme de 99,92-100,04%. Les quantités de médicament ajoutées et déterminées ainsi que le pourcentage de récupération sont indiqués dans le tableau 2. La pureté du pic de thiocolchicoside a été confirmée par l’évaluation des études spectrales aux positions de début de pic, de sommet de pic et de fin de pic de la bande, c’est-à-dire (, ) = 0,9995 et (, ) = 0,9986 montrant la spécificité de la méthode (Figure 4). Une bonne corrélation ( = 0,9989) a été obtenue entre le médicament standard et le médicament extrait de la formulation de la capsule. La robustesse de la méthode a été testée en modifiant délibérément les conditions chromatographiques, et l’effet sur le chromatogramme a été observé. L’écart-type des surfaces de pic a été calculé pour chaque paramètre, et le % RSD s’est avéré inférieur à 2 %. Les faibles valeurs du % RSD indiquent la robustesse de la méthode ; les résultats sont présentés dans le (Tableau 3). La robustesse de la méthode a été vérifiée par différents analystes et le % RSD a été trouvé à 0,57 et 0,58 il indique que la méthode est robuste.

Figure 4

Spectres de pic de pureté du thiocolchicoside standard (a) et du thiocolchicoside extrait de la capsule (b) balayés aux positions pic-début, pic-apex et pic-fin.

3.4. Analyse de la formulation commercialisée

La thiocolchicoside lorsqu’elle est extraite de la formulation de la capsule a démontré une seule tache ayant = 0,60 ± 0,02 dans le chromatogramme. La teneur moyenne en % de médicament s’est avérée être 100,27% de l’allégation de l’étiquette avec 0,88% RSD.

3.5. Stabilité-Propriété indicatrice

3.5.1. Dégradation acide

La dégradation forcée du thiocolchicoside dans du HCl 1,0 M (60°C pendant 30 min) s’est avérée instable et a montré deux pics supplémentaires aux valeurs 0,33 et 0,71 (figure 5(a)). Les spots des produits dégradés étaient bien séparés du spot du thiocolchicoside.

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 5

RP-Chromatogrammes HPTLC obtenus à partir de thiocolchicoside dégradé par (a) hydrolyse acide (1 M HCl), (b) hydrolyse alcaline (0.5 M NaOH), (c) un stress oxydatif (1% v/v H2O2), et (d) un stress oxydatif (3% v/v H2O2).

3.5.2. Dégradation basique

On a constaté que le thiocolchicoside était instable pendant l’hydrolyse alcaline dans du NaOH 0,5 M à 60°C pendant 30 min. Le médicament a montré un pic supplémentaire à la valeur 0,72 avec le thiocolchicoside resté à 0,60 (Figure 5(b)). Les spots des produits dégradés étaient bien séparés des spots du médicament.

3.5.3. Dégradation oxydative

Le thiocolchicoside possède un atome de soufre, qui est plus sensible à l’oxydation par H2O2. Après traitement du thiocolchicoside avec 1% v/v de H2O2, trois pics supplémentaires aux valeurs 0,38, 0,46 et 0,70 ont été observés en même temps que le thiocolchicoside est resté à 0,60 (Figure 5(c)). Dans la dégradation oxydative avec 3% v/v H2O2, le thiocolchicoside a subi une dégradation complète résultant en deux pics majeurs à des valeurs de 0,58 et 0,64 et un pic à 0,70, respectivement (Figure 5(d)). Les spectres de pureté du thiocolchicoside récupéré après dégradation dans 1 M HCl, 0.5 M NaOH, et 1% v/v H2O2 et le standard de thiocolchicoside scanné aux positions de début de pic, pic-apex, et fin de pic du spot sont montrés dans (Figure 6). Les résultats des essais sous contrainte ont révélé que la méthode était hautement spécifique pour le thiocolchicoside. Les produits de dégradation étaient entièrement perceptibles à partir du composé parent. Aucune décomposition n’a été identifiée lors de l’exposition de la solution de médicament à la lumière du soleil pendant la dégradation photo et thermique, ce qui indique la stabilité du médicament dans les deux conditions. Les résultats de l’étude de dégradation forcée du thiocolchicoside sont résumés dans (tableau 4).

Figure 6

Spectres de pureté de pointe du thiocolchicoside récupéré après dégradation dans 1 M HCl, 0.5 M NaOH, 1% v/v H2O2, des dégradants et de l’étalon de thiocolchicoside balayés aux positions pic-début, pic-apex et pic-fin.

4. Conclusion

Dans la présente étude, la dégradation forcée du thiocolchicoside a été réalisée pour élucider sa stabilité chimique inhérente. A cette fin, une méthode RP-HPTLC a été développée. La méthode développée s’est avérée simple, rapide, sélective, sensible et appropriée pour la détermination du thiocolchicoside dans le matériau en vrac et la formulation de la capsule. Au cours de l’étude, il a été constaté que le thiocolchicoside est sensible à l’hydrolyse acide et basique ainsi qu’à l’oxydation. Comme la méthode est un indicateur de stabilité, elle peut être utilisée pour déterminer la pureté du médicament disponible à partir de diverses sources en détectant les impuretés liées. En outre, on peut conclure que les impuretés présentes dans le médicament pourraient être dues à l’hydrolyse ou à l’oxydation pendant le traitement et le stockage du médicament.

Conflit d’intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Reconnaissance

Les auteurs remercient le R. C. Patel Institute of Pharmaceutical Education and Research, Shirpur (M.S.), Inde, pour avoir fourni les installations nécessaires à la réalisation de ce travail de recherche.