- Abstract
- 1. Introduction
- 2. Matériel et méthodes
- 2.1. Sujets
- 2.2. Prélèvement sanguin
- 2.3. Extraction des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)
- 2.4. Extraction de l’ARN et synthèse de l’ADNc
- 2.5. Conception des amorces
- 2.6. Évaluation des facteurs biochimiques sériques
- 2.7. Analyse et interprétation des résultats
- 3. Résultat
- 3.1. Résultats de la qRT-PCR
- 3.2. Évaluation de l’expression des gènes dans les PBMC
- 4. Discussion
- Conflit d’intérêts
- Remerciements
Abstract
Les gènes ABCA1 et ABCG1 codent pour les protéines transporteuses du cholestérol qui jouent un rôle clé dans l’homéostasie du cholestérol et des phospholipides. Cette étude avait pour but d’évaluer et de comparer l’expression des gènes ABCA1 et ABCG1 chez les patients atteints du syndrome métabolique et les individus sains. Cette étude cas-témoins a été réalisée sur 36 patients atteints de syndrome métabolique et le même nombre d’individus sains à Hamadan (ouest de l’Iran) en 2013-2014. L’ARN total a été extrait des cellules mononucléaires et purifié à l’aide de la colonne du RNeasy Mini Kit. L’expression des gènes ABCA1 et ABCG1 a été réalisée par qRT-PCR. Le profil lipidique et la glycémie à jeun ont été mesurés par des procédures colorimétriques. L’expression d’ABCG1 chez les patients atteints du syndrome métabolique était significativement plus faible (environ 75 %) par rapport à celle du groupe témoin, tandis que pour l’expression d’ABCA1, il n’y avait pas de différence significative entre les deux groupes étudiés. La comparaison d’autres paramètres tels que le HDL-C, le FBS, l’IMC, le tour de taille et la pression artérielle systolique et diastolique entre les patients atteints du syndrome métabolique et les individus sains a montré des différences significatives (). La diminution de l’expression d’ABCG1 chez les patients atteints du syndrome métabolique par rapport aux individus sains suggère que l’hyperglycémie, les métabolites associés et l’hyperlipidémie dépassent la capacité du transporteur et entraînent une diminution de l’expression d’ABCG1. L’absence d’un changement significatif dans l’expression du gène ABCA1 entre deux groupes peut indiquer un mécanisme de régulation différent pour l’expression d’ABCA1.
1. Introduction
Le syndrome métabolique (MetS) est défini comme un ensemble de facteurs de risque interdépendants de diabète et de maladies cardiovasculaires (MCV) . Il existe certains critères pour le diagnostic clinique du syndrome métabolique qui comprennent un tour de taille élevé (≥102 cm chez les hommes et ≥88 cm chez les femmes), des triglycérides élevés (≥150 mg/dL ou 1.7 mmol/L), un taux réduit de cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL-C <40 mg/dL ou 1,03 mmol/L chez les hommes et <50 mg/dL ou 1,3 mmol/L chez les femmes) et une pression artérielle élevée (pression artérielle systolique ≥130 mm Hg ou pression artérielle diastolique ≥85 mm Hg) . Le MetS peut être diagnostiqué par l’observation de trois de ces critères. Au cours des dernières années, la prévalence du MetS a augmenté dans le monde entier ; cependant, aux États-Unis d’Amérique, elle a diminué de 25,5 % en 1999/2000 à 22,9 % en 2009/2010 . Weiss et ses collègues ont signalé que l’obésité est directement associée à une prévalence accrue de MetS . Il existe une association inverse entre les MCV et le taux plasmatique de HDL-C, l’un des critères du syndrome métabolique. Les lipoprotéines de haute densité, une sous-fraction des lipoprotéines circulatoires, jouent un rôle important dans le transport du cholestérol des tissus périphériques vers les cellules hépatiques. Les HDL sont riches en protéines Apo A-I et Apo A-II, et plus des deux tiers de leur contenu sont des Apo A-I .
Les transporteurs transmembranaires ABC jouent un rôle important dans l’absorption du cholestérol des macrophages vers les HDL et diminuent la formation de cellules spumeuses . ABCA1 composé de 2261 acides aminés présent dans la plupart des tissus. Ces dernières années, il a été démontré que ABCA1 joue un rôle essentiel dans la protection contre les maladies cardiovasculaires. La synthèse du HDL dépend directement de l’activité de l’ABCA1 dans les cellules du foie ; en d’autres termes, il a une fonction clé dans la protection des cellules artérielles contre les cellules spumeuses en augmentant le HDL plasmatique. L’activité ABCA1 des macrophages artériels a montré une association inverse avec la formation de cellules spumeuses, car avec l’augmentation de son activité, la formation de cellules spumeuses diminuera .
L’activité ABCA1 réduite ou altérée pourrait causer certaines maladies comme le diabète de type 2 , la maladie de Tangier , et les MCV prématurées .
Le gène ABCG1 est situé sur le chromosome 21q22.3 . ABCA1 et ABCG1 conduisent tous deux à la réduction du cholestérol tissulaire par son efflux vers les HDL, mais ABCG1 transporte le cholestérol tissulaire vers les HDL2 et HDL3 et ABCA1 le transporte vers l’Apo A-I sans lipides . Les macrophages sont le tissu le plus important de l’action d’ABCA1 et d’ABCG1 . Dans de nombreuses études, les effets de l’upregulation et de la downregulation de ces gènes ont été examinés.
La réduction de l’efflux de cholestérol est la conséquence de l’absence d’expression d’ABCA1 in vitro ; elle peut conduire à une augmentation de l’athérosclérose , mais l’upregulation d’ABCA1 entraîne une réduction de l’athérosclérose . La régulation à la baisse d’ABCG1 a également les mêmes effets sur l’efflux de cholestérol, mais les résultats sont controversés quant à l’impact de la régulation à la baisse d’ABCG1 sur l’athérosclérose.
Dans le MetS, les modèles d’expression de certains gènes changent et peuvent conduire à l’obésité, au diabète et à l’hypertension. Dans la présente étude, nous avons cherché à évaluer l’expression des gènes ABCA1 et ABCG1 chez les patients atteints de MetS, car ces gènes sont impliqués dans la synthèse des transporteurs qui ont un rôle crucial dans le transport du cholestérol.
2. Matériel et méthodes
2.1. Sujets
Cette étude cas-témoins a été réalisée sur des patients qui ont été référés à un service d’endocrinologie dans un hôpital de Hamadan (ouest de l’Iran) au cours de 2013-2014. Trente-six patients atteints de syndrome métabolique ont été sélectionnés. De même, 36 individus sains appariés en âge et en sexe ont été sélectionnés comme groupe de contrôle. Aucun des individus sains n’avait les critères du syndrome métabolique.
Le critère d’inclusion dans le groupe du syndrome métabolique était d’avoir trois sur cinq des caractéristiques mentionnées ci-dessus. Les patients ayant des antécédents de consommation de médicaments antilipidiques, contraceptifs et diurétiques ont été exclus de l’étude. Les patientes enceintes et les patients souffrant de diabète, d’inflammation et d’infection ont également été exclus.
2.2. Prélèvement sanguin
Un échantillon de sang de 2,5 ml de chaque sujet a été ajouté à un tube contenant de l’EDTA et a été conservé à 4°C pour l’extraction de l’ARN (pas plus de deux heures plus tard).
2.3. Extraction des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)
Les solutions de Lymphodex (Allemagne) et de Henx (Iran) ont été utilisées pour l’isolement des PBMC. Environ 2 mL de la solution Henx ont été ajoutés à un volume égal de sang et mélangés complètement ; puis ils ont été versés sur 3 mL de solution Lymphodex soigneusement et lentement. Ensuite, le mélange a été placé sur le Lymphodex et a été centrifugé à 1000 g pendant 20 minutes. La couche blanche intermédiaire entre le plasma et le Lymphodex a été isolée en tant que cellules mononucléaires (CM) ; le tampon de Henx a ensuite été ajouté aux CM, mélangé complètement et centrifugé. Enfin, le surnageant a été jeté et le processus a été répété une fois de plus.
2.4. Extraction de l’ARN et synthèse de l’ADNc
L’extraction nette de l’ARN a été réalisée à l’aide du kit de purification de l’ARN Gene JET selon le protocole du fabricant. La qualité et la quantité de l’ARN purifié ont été analysées à l’aide d’un NanoSpectrophotomètre (Epoch, BioTek, USA) ; puis l’intégrité de chaque échantillon d’ARN a été examinée en utilisant un gel d’agarose à 1%, 1x TBE.
L’ARN a été converti en ADNc en utilisant le kit de synthèse d’ADNc de premier brin RevertAid (K1622) en suivant le protocole : étape 1 : recuit des amorces à 25°C pendant 5 min ; étape 2 : synthèse de l’ADNc à 42°C pendant 60 min ; étape 3 : inactivation thermique à 70°C pendant 5 min. Les produits ont été stockés à -80°C pour les étapes suivantes.
2.5. Conception des amorces
Les amorces spécifiques pour chaque gène ont été conçues par le logiciel Allele ID (version 7.6). Afin d’augmenter la spécificité de la réaction PCR en temps réel et de réduire les résultats faussement positifs, une amorce de chaque paire a été conçue pour être attachée à la zone de jonction Exon-Exon. Les critères précis des amorces utilisées pour chaque gène sont présentés dans le tableau 1. Le gène de maintien de l’ARNr 18S a été utilisé comme contrôle interne.
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L’expression relative des gènes a été calculée en mesurant la valeur du cycle seuil (CT) pour chaque échantillon en utilisant le thermocycleur C1000 et le système en temps réel CFX96 (Bio-Rad, USA) et le kit SYBR Premix Ex Taq 2 (TakaRa No. RR820L). La moyenne de la CT dans les essais triples de chaque échantillon a été déterminée comme valeur de la CT. Les quantités d’ingrédients de la réaction qRT-PCR comprenaient 10 μL de SYBR green, 7 μL d’eau désionisée et 1 μL de chacune des amorces avant, des amorces inverses et de la matrice. La qRT-PCR a été réalisée dans ces conditions : activation initiale à 95°C pendant 30 secondes, puis 40 cycles des étapes suivantes répétées : dénaturation à 95°C pendant 5 secondes, recuit à la température de recuit optimisée pour la durée appropriée de chaque gène, et extension à 72°C pendant 30 secondes, et à la fin, les données ont été acquises en augmentant la température de 72°C à 95°C pendant 0,5°C/0,05 seconde. Ensuite, les produits PCR ont été électrophorés (sur gel d’agarose à 1%, 1x TBE) pour vérifier la spécificité des amplicons.
2.6. Évaluation des facteurs biochimiques sériques
Un échantillon de sang de deux millilitres a été prélevé sur chaque sujet et centrifugé à 3000 tours/minute pendant 10 min pour la séparation du sérum. Le cholestérol total (CT), le LDL-C, les TG, le FBS et le HDL-C ont été examinés à l’aide du kit Pars Azmun (Iran) par Hitachi 911 (Allemagne).
2.7. Analyse et interprétation des résultats
formule a été utilisée pour l’analyse de l’expression relative des gènes du syndrome métabolique et des groupes de contrôle. L’efficacité de la PCR en temps réel a été calculée pour chaque gène en utilisant une dilution de 10-2 ; par la suite, le nombre obtenu a été placé dans la formule de calcul suivante pour mesurer les changements de plis de l’expression des gènes :Le logiciel SPSS V.16 a été utilisé pour l’analyse statistique avec des intervalles de confiance de 95%. La distribution normale des variables a été vérifiée par la méthode de Kolmogorov-Smirnov, puis les valeurs ont été comparées entre deux groupes via le -test des échantillons indépendants.
3. Résultat
Les caractéristiques démographiques et les facteurs biochimiques des groupes étudiés sont présentés dans le tableau 2. Le rapport hommes/femmes était de 1/3 dans chaque groupe (12 M et 24 F). Comme le montre le tableau 2, les différences dans tous les paramètres examinés étaient statistiquement significatives entre les deux groupes () à l’exception de l’âge et du LDL-C. Le groupe du syndrome métabolique présentait un IMC, un LDL-C, un TC, un TG, un FBS, une pression artérielle diastolique/diastolique et un tour de taille plus élevés par rapport aux individus sains, tandis que le HDL-C était significativement plus faible dans le syndrome métabolique.
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BMI : indice de masse corporelle ; FBS : sucre sanguin rapide ; TG : triglycéride, HDL-C : cholestérol à lipoprotéines de haute densité ; LDL-C : cholestérol à lipoprotéines de basse densité ; différence significative. |
3.1. Résultats de la qRT-PCR
Après achèvement de la réaction PCR, les résultats ont été vérifiés par l’analyse de la courbe de réaction, de la courbe de fusion des produits et de l’électrophorèse des produits PCR. L’électrophorèse a été réalisée sur de l’agarose à 1% en utilisant une échelle d’ADN de 100 pb. Les résultats sont présentés dans la figure 1.
3.2. Évaluation de l’expression des gènes dans les PBMC
Les niveaux d’expression des gènes ont été mesurés dans les cellules mononucléaires du sang périphérique et comparés entre deux groupes par le calcul du ΔCT pour chaque gène. Il n’y avait pas de différence dans l’expression d’ABCA1 entre les deux groupes mais l’expression d’ABCG1 était significativement plus faible dans le groupe MetS (). Les résultats détaillés sont présentés dans le tableau 3.
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Significatif. |
De plus, le calcul du changement de pli de l’expression d’ABCG1 () a indiqué une expression 3,1 fois plus faible dans le groupe MetS.
4. Discussion
ABCA1 et ABCG1 ont un rôle crucial dans le transport inverse du cholestérol des tissus périphériques tels que les macrophages vers le foie . Cependant, l’expression des gènes ABCA1 et ABCG1 a été étudiée dans certaines maladies ; nous n’avons pas trouvé de rapport sur ce sujet dans le syndrome métabolique. Dans cette étude, nous avons examiné l’expression de ces gènes chez des sujets atteints du syndrome métabolique et des individus sains.
Alors qu’il n’y avait pas de différence significative dans l’expression du gène ABCA1 entre les deux groupes étudiés, nous avons trouvé une expression significativement plus faible (environ 75%) de l’ABCG1 chez les sujets atteints du syndrome métabolique par rapport au groupe témoin. Singaraja et al. ont montré que la réduction d’ABCA1 dans les macrophages et les reins est associée à une augmentation de la teneur en cholestérol . Ils ont conclu que l’altération de l’exportation du cholestérol médiée par ABCA1 pourrait contribuer à l’augmentation de l’athérosclérose et de la néphropathie associées au diabète. Certains rapports tentent d’aborder les mécanismes possibles qui régulent l’expression de ces gènes. Récemment, il a été démontré que les polymorphismes dans ABCA1 et ABCC8 peuvent être associés au syndrome métabolique. Il existe des preuves montrant que la perturbation de la fonction d’ABCA1, qui peut être le résultat d’une mutation de ce gène, peut entraîner une hypoalphalipoprotéinémie familiale qui se caractérise par un faible taux de HDL et un dépôt accru d’esters de cholestérol dans plusieurs tissus et cellules. Il a également été démontré que la surexpression du gène ABCA1 peut conférer une protection contre l’athérosclérose. Ces données sont cohérentes avec nos résultats et soutiennent cette idée qu’une expression plus faible du gène ABCA1 peut contribuer aux complications du syndrome métabolique.
Haghpassand et al. ont démontré que l’expression du gène ABCA1 dans les PBMCs a une relation directe avec la charge en cholestérol, et la surexpression d’ABCA1 conduit au transfert de l’excès de cholestérol vers les apoprotéines . Wang et al. ont étudié le transport inverse du cholestérol chez des souris knock-down ABCA1 et ABCG1 et ont conclu que lorsque ABCA1 et ABCG1 étaient knock-down, le transport inverse du cholestérol était plus important par rapport à ABCG1 knock-down.
Depuis que Mauerer et al. ont souligné que le niveau élevé de glucose (hyperglycémie) est impliqué dans la réduction de l’expression d’ABCA1 et ABCG1 in vitro, il semble logique de s’attendre à des changements similaires dans le MetS. Les promoteurs d’ABCA1 et ABCG1 possèdent un site récepteur pour LXR et RXR ; lorsque l’oxycholestérol et l’acide rétinoïque s’associent à ces facteurs, l’expression d’ABCA1 et ABCG1 est accrue. De plus, l’AMPc et le NFκB sont des facteurs de transcription pour ABCA1 et ABCG1, respectivement.
Les résultats obtenus indiquent une diminution significative de l’expression d’ABCG1 chez les patients atteints du syndrome métabolique par rapport aux individus sains. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie, les métabolites associés et l’hyperlipidémie sur la capacité du transporteur peuvent conduire à une diminution de l’expression d’ABCG1. Comme aucun changement significatif n’a été observé dans l’expression du gène ABCA1, cela peut être dû à un mécanisme de régulation différent. Comme les structures de ces gènes sont différentes et qu’ils sont régulés par divers facteurs transcriptionnels, nos résultats peuvent être justifiés. Néanmoins, le nombre limité d’échantillons dans cette étude est un autre facteur pour l’absence de changements dans l’expression d’ABCA1.
L’autre point est que nous avons examiné l’expression de ces gènes dans les PBMC des sujets étudiés ; il est important de noter que les changements dans l’expression de ces gènes dans les monocytes peuvent être différents de ceux dans les autres tissus clés tels que le foie et l’intestin, qui sont les principaux sites de synthèse des HDL. En outre, les changements dans les niveaux d’ARNm n’impliquent pas nécessairement des changements dans la protéine correspondante.
Conflit d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Remerciements
Cet article est extrait de la thèse de maîtrise de Zahra Tavoosi. Les auteurs tiennent à remercier l’Université des sciences médicales de Hamadan pour avoir soutenu financièrement cette étude.