Frontières en Microbiologie

Introduction

Les bactériophages sont entrés dans le champ de la recherche scientifique, car ils jouent un rôle important dans presque toutes les communautés microbiennes. En tant que prédateurs viraux des bactéries, ils ont une influence substantielle sur les populations microbiennes et leur dynamique dans différents environnements. Il existe plusieurs revues traitant du rôle des bactériophages dans différents habitats tels que les mers ou le corps humain (Clokie et Mann, 2006 ; Wahida et al., 2016 ; Łusiak-Szelachowska et al., 2017). Depuis leur découverte il y a plus de 100 ans, séparément par Frederick Twort puis par Felix D’Herelle (Salmond et Fineran, 2015), les bactériophages ont été utilisés dans les pays d’Europe de l’Est pour le traitement médical des infections bactériennes, alors que dans le reste du monde les antibiotiques étaient les protagonistes (Myelnikov, 2018). Aujourd’hui, alors que les infections par des bactéries multirésistantes sont devenues une menace mondiale (Zaman et al…, 2017), des patients du monde entier sont traités à l’Institut Eliava des bactériophages, de la microbiologie et de la virologie, à Tbilissi, en Géorgie, qui a peut-être la plus longue expérience en matière de thérapie par bactériophages (Kutateladze et Adamia, 2008), ainsi que dans l’unité de thérapie par bactériophages de l’Institut Ludwik Hirszfeld d’immunologie et de thérapie expérimentale à Wrocław, en Pologne (Międzybrodzki et al., 2012). L’application des bactériophages pourrait être non seulement une solution précieuse dans le secteur médical, mais aussi dans d’autres domaines où les bactéries peuvent avoir un impact négatif.

Certaines entreprises aux États-Unis, comme OmniLytics Inc. (Sandy, UT, États-Unis) et Intralytix Inc. (Baltimore, MD, États-Unis) ont développé différents produits à base de bactériophages pour l’application comme désinfectants dans l’industrie alimentaire qui peuvent être utilisés contre Salmonella, Escherichia coli et Listeria monocytogenes. En Europe, une société néerlandaise Micreos BV (Wageningen, Pays-Bas) a également commercialisé des produits bactériophages contre Salmonella et E. coli et une société allemande, Fink Tec (Hamm, Allemagne), ciblant E. coli (Moye et al., 2018). Une application plus large des bactériophages est attendue dans la chaîne de valeur alimentaire, y compris l’agriculture et l’aquaculture, où un large spectre d’agents pathogènes divers pour les plantes et les poissons provoque des pertes économiques importantes (Buttimer et al., 2017 ; Doss et al., 2017).

Bien que certains produits bactériophages soient déjà commercialisés, un processus efficace, constant et contrôlable pour la production de bactériophages reste à réaliser. La production de phages en laboratoire peut être considérée comme un processus de routine, et les protocoles sont bien définis ; cependant, ces processus ne sont pas facilement transposables à plus grande échelle. Les entités industrielles ont le principal intérêt d’obtenir des méthodes fiables pour la production de phages qui permettent la mise à l’échelle du processus. Cependant, la solution n’est pas facile, en raison de la nature biologique du système et des divers types d’interactions qui se produisent entre les phages et les bactéries.

Il y a eu plusieurs tentatives pour générer des méthodes fiables pour la production de bactériophages. Certains chercheurs ont utilisé une approche théorique avec des modèles de simulation, tandis que d’autres ont adopté une approche pratique par le biais d’expériences. Cette mini-revue examine des exemples choisis des deux approches, en contrastant leurs principales différences.

Généralités dans la production de bactériophages

La nature biologique des bactériophages oblige leur reproduction dans la cellule hôte. Par conséquent, une méthode de production de bactériophages nécessite un processus de production impliquant au moins deux unités opérationnelles, la croissance de la bactérie hôte et la propagation (ou infection) du bactériophage. Il est important de prendre en compte les paramètres de base de la croissance bactérienne et de l’infection par les phages, tels que les substrats sélectionnés pour la bactérie et la température optimale, tant pour la croissance bactérienne que pour l’infection par les phages, car ces facteurs peuvent influencer l’infectivité des phages (Tokman et al., 2016). De même, il est important de connaître la biologie du phage à produire, y compris les différents paramètres d’infection tels que le taux d’adsorption, la taille du burst et la période de latence ; cependant, comme nous le verrons plus tard, ces paramètres peuvent changer en fonction des conditions d’infection (Santos et al., 2014). Plus important encore, il est recommandé d’avoir une compréhension approfondie des interactions spécifiques qui peuvent se produire entre l’hôte bactérien et le phage sélectionné, comme la présence d’un système CRISPR-cas dans la bactérie, car ces facteurs peuvent avoir une forte influence sur le processus d’infection du phage (Levin et al., 2013). Il est également recommandé de sélectionner une souche bactérienne non virulente comme hôte. La production de bactériophages au niveau industriel nécessitera de grandes quantités de la bactérie hôte, donc éviter l’utilisation de pathogènes virulents résistants aux médicaments, et surtout multirésistants, devrait être obligatoire dans un processus de production de phages (Torres-Barceló, 2018). Il en va de même pour les bactéries porteuses de prophages, car ils pourraient être induits au cours du processus, modifiant le résultat final (Stewart et Levin, 1984).

Un processus fiable pour la production de bactériophages à grande échelle peut être très insaisissable, car les données obtenues en laboratoire ne sont pas toujours utiles pour la mise à l’échelle des processus biologiques (Kwok, 2010). Les chercheurs ont tenté de combler cette lacune principalement par des études sur la production de bactériophages basées sur des simulations informatiques, dont certaines ont été validées expérimentalement. Ici, nous analyserons d’abord les études théoriques axées sur les modèles de production de phages, puis les études sélectionnées qui ont été validées expérimentalement. Tous les cas sont en accord avec les critères d’analyse pour la purification et la validation ultérieures d’un produit à base de bactériophages, et certains d’entre eux sont inclus dans les deux sections (Santos et al., 2014 ; Nabergoj et al., 2018a).

Modèles théoriques pour la production de bactériophages

Pour décrire un processus de production de phages à travers un modèle mathématique, il est important de définir les paramètres cinétiques à inclure dans le modèle. Les trois paramètres de base pour la production de phages sont les populations de bactéries sensibles non infectées, de bactéries infectées par des phages et de phages libres (Krysiak-Baltyn et al., 2016). À partir de là, différents modèles ont inclus des variables supplémentaires telles que des bactéries résistantes non infectées (Santos et al., 2014 ; Chaudhry et al., 2018) ou des espèces bactériennes multiples (Levin et al., 1977). Toutes ces populations interagissent contrôlées par des paramètres cinétiques associés à la croissance bactérienne et à l’infection par les phages. On considère que l’on sait bien quelles constantes sont importantes pour les bactéries ; cependant, cela reste en discussion pour les bactériophages. Il existe un consensus sur le fait que la constante d’adsorption, la période de latence et la taille de l’éclatement sont des variables importantes à prendre en compte ; cependant, leur pertinence dans le modèle varie entre les différentes études. De plus, les différents auteurs utilisent une nomenclature différente pour définir les paramètres cinétiques, ce qui constitue l’une des principales difficultés pour établir des comparaisons entre les différents modèles et pour unifier les connaissances générales sur ce sujet. Par exemple, le taux d’adsorption des phages (indicateur des particules de phages adsorbées sur les bactéries) est communément désigné par le symbole « δ » ; cependant, Beretta et Kuang (1998) ont utilisé le symbole « K », qui peut également être le symbole de la constante de Monod de spécificité du substrat « Ks ». D’autres exemples de nomenclatures différentes peuvent être trouvés dans le tableau 1. Comme dans d’autres processus biologiques, on s’attend à ce que les auteurs travaillant dans le domaine des modèles de croissance des phages-bactéries s’accordent sur un vocabulaire algébrique spécifique ou incluent une explication claire des termes et des unités dans leurs articles et une nomenclature claire, comme l’ont récemment déclaré Krysiak-Baltyn et al. (2018). Sur la base de la nomenclature utilisée par d’autres auteurs (tableau 1), nous proposons l’utilisation de caractères grecs pour nommer les différents paramètres cinétiques de la reproduction des phages. La taille du burst peut être symbolisée par β, le taux d’adsorption par δ, le temps d’éclipse par ε et le taux de désintégration du phage par λ. Les seules exceptions seraient la concentration du phage, communément appelée  » P « , et le temps de latence, appelé  » L « . L’uniformité de ce langage mathématique facilitera la compréhension et l’exploration des données pour les futurs examinateurs universitaires ou industriels.

Depuis Campbell (1961), de nombreux efforts ont été faits pour décrire des modèles de production de bactériophages, décrivant le comportement des populations de phages dans plusieurs conditions et méthodes. Le tableau 1 résume les différents modèles de production de phages, donnés sous forme d’équations différentielles ou intégrales (selon la décision de chaque auteur), en mentionnant les considérations spécifiques à chaque modèle.

Les modèles de production de phages sont généralement cohérents pour décrire l’évolution de la population de phages dans le temps. Cela peut être représenté comme un changement cinétique des particules de phages ou des unités formatrices de plaques (PFU) par unité de temps, des concentrations finales obtenues après un processus discontinu, ou pendant une période de temps dans un processus continu. Malgré le consensus général, ces modèles diffèrent sur plusieurs points. Les modèles proposés par Campbell (1961) et Beretta et Kuang (1998) sont cohérents dans l’équilibre des particules de phages avec les termes de génération (libération de particules de bactériophages par unité de temps) et la perte de bactériophages libres due aux taux d’adsorption ou de désintégration ; ces modèles sont utiles en raison de leur simplicité et de l’utilisation de paramètres standard de croissance des phages comme le taux d’adsorption, la taille de l’éclatement et le temps de latence, et constituent un moyen rapide de simuler des processus de production par lots, mais ils ne peuvent pas s’adapter à des processus comme les populations de bactéries résistantes ou l’évolution des phages dans le temps. Ces modèles ont également tendance à sous-estimer l’influence de paramètres tels que la taille du burst et la période de latence, alors que des modèles plus récents ont montré l’importance de ces paramètres et la façon dont ils peuvent varier en fonction d’autres facteurs (Santos et al., 2014 ; Nabergoj et al., 2018b).

Un modèle intéressant récemment proposé par Santos et al. (2014) prend en compte l’influence du taux de croissance bactérienne sur la constante d’adsorption du phage et une équation de distribution normale qui régit les valeurs de la période de latence, en tenant compte de la variabilité de ces paramètres. Ce modèle s’est avéré très utile car il offre la possibilité d’évaluer l’influence du substrat dans la production de phages, et l’inclusion du taux de croissance bactérienne dans le modèle offre un outil indirect pour considérer l’état physiologique des bactéries au cours du processus. La dépendance des paramètres d’infection bactériophagique au taux de croissance bactérienne a ensuite été également explorée par d’autres auteurs (Krysiak-Baltyn et al., 2018 ; Nabergoj et al, 2018b) ; Nabergoj et ses collègues ont constaté que la taille de l’éclatement augmentait linéairement avec le taux de croissance bactérienne, tandis que la constante d’adsorption et la période de latence diminuaient.

D’autres modèles ont exploré l’influence de plusieurs espèces bactériennes, et l’apparition de la résistance bactérienne (Levin et al., 1977 ; Santos et al., 2014 ; Chaudhry et al., 2018). Bien que l’objectif de ces études ne soit pas toujours de développer des méthodes de production de phages, elles sont utiles pour décrire les situations potentielles qui peuvent se produire au cours du processus. Ces modèles incluent des variables associées aux taux de sélection et de réversion de la résistance bactérienne en fonction de la population bactérienne (disponibilité de bactéries moins ou plus sensibles au fil du temps), définissant les conditions dans lesquelles les bactéries sensibles et résistantes peuvent coexister, comme un fort désavantage sélectif chez les bactéries résistantes (par exemple un taux de croissance plus faible), et/ou l’existence d’un refuge spatial (ou refuge de densité) où (en dessous duquel) le phage n’est pas capable d’infecter les bactéries. Chaudhry et al. (2018) ont proposé une explication intéressante de la façon dont les phages peuvent persister dans des populations dominées par des bactéries résistantes, en suggérant que ces dernières pourraient produire des bactéries sensibles à des fréquences qui permettraient la réplication des phages. Il est intéressant de noter que ce phénomène a déjà été suggéré auparavant (Bastías et al., 2010). La génération de souches résistantes aux phages dans les systèmes de production de phages pourrait être une source de préoccupation et devrait donc être incluse dans le développement de nouvelles méthodes, afin de minimiser cette possibilité. Plusieurs auteurs ont suggéré que ce problème peut être évité avec la configuration de production de phages, qui sera discutée dans la section suivante.

Une autre étude intéressante est celle de Krysiak-Baltyn et al. (2018), qui intègre également des paramètres d’infection variables en fonction du taux de croissance bactérienne, et estime le coût opérationnel et la productivité dans un système de processus simulé à deux étapes. L’une des conclusions importantes de cette étude théorique est que la concentration optimale de substrat pour la croissance bactérienne ne devrait pas nécessairement être la même pour la production de bactériophages, et selon leur analyse, le coût par mL de phages à une concentration de 4 × 1010 phages/mL pourrait être aussi bas que 1,78 × 10-2 $. Il serait intéressant d’avoir une validation expérimentale de cette estimation, et de déterminer comment elle est adaptée à différentes économies ou pays.

Enfin, l’évolution des bactériophages doit également être considérée dans un processus de production, puisque les phages pourraient augmenter ou diminuer leur efficacité à infecter les bactéries au fil du temps (Lenski et Levin, 1985). Ce concept pourrait être représenté par les taux d’infection dans les expériences de gamme d’hôtes, où même les méthodes d’expansion de la gamme d’hôtes peuvent être réalisées pour les applications de thérapie par phages (Mapes et al., 2016). Cette situation a été simulée dans des cultures discontinues, montrant que l’apparition de mutants de phages dépend fortement de la flexibilité génétique des phages (taux de mutations) (Levin et Bull, 2004). La capacité de prédire l’évolution des phages pendant la production serait utile pour mettre en place un processus de production minimisant la probabilité d’altérer les propriétés lytiques des phages. Les articles examinés montrent que les modèles de production de bactériophages sont une approche importante qui peut aider à trouver les meilleures stratégies, cependant, ils doivent être validés expérimentalement.

Expériences expérimentales dans la production de bactériophages

Il existe plusieurs études pratiques impliquant la production de phages. Certaines sont axées sur la production de phages dans des bioréacteurs, tandis que d’autres se concentrent sur l’évaluation et l’optimisation du processus. Comme prévu, ces expériences considèrent également une étape de croissance bactérienne et d’infection/propagation des phages dans des flacons et des bioréacteurs (tableau 2). Ces données sont utiles pour donner un aperçu de la façon dont certains modèles d’hôte-bactériophage peuvent être utilisés pour la propagation et l’augmentation des niveaux de production de phages. Les systèmes hôte-phage les plus couramment utilisés sont les souches d’E. coli et leurs phages, probablement en raison de la quantité d’informations concernant ces systèmes bactériophage (phages T3, T4 et T7 d’E. coli) et du manque d’informations sur les autres systèmes bactériophage.

Selon un cas rapporté, les titres obtenus peuvent atteindre 1,2 × 1016 UFP mL-1 dans un bioréacteur batch (5 L) (Sochocka et al., 2015). Ce niveau de production concorde avec la production nécessaire à des fins thérapeutiques (>1 1010 PFU mL-1), en considérant les étapes de purification, le taux de désintégration des phages et la stabilité ou la durée de conservation (Naghizadeh et al., 2018). D’autres auteurs ont également rapporté des niveaux de production prometteurs de 5 × 1012 PFU mL-1 dans 1,2 L (Warner et al., 2014), et de 2,4 × 1013 PFU jour-1 dans 1 L (Nabergoj et al., 2018a ; tableau 2).

Il est difficile d’établir des comparaisons sur la méthode qui pourrait être la plus efficace, car elles utilisent des procédures de culture différentes et des systèmes hôte-bactériophage différents. La culture discontinue est le moyen le moins cher (et non le plus simple) de produire des bactériophages, mais elle est fortement limitée par le volume maximal de l’équipement disponible, les durées totales d’opération et la disponibilité du substrat (des concentrations plus élevées peuvent être inhibitrices pour la croissance bactérienne). La culture continue est plus évolutive lorsqu’on optimise le taux de dilution des bactéries en modifiant les flux d’entrée et de sortie. En outre, la régulation du taux de dilution permettra de contrôler directement le taux de croissance bactérienne, qui a une influence directe sur les paramètres d’infection comme la taille de l’éclatement, la constante d’adsorption et la période de latence (Mancuso et al., 2018 ; Nabergoj et al., 2018b). Le taux de dilution peut également être utilisé pour augmenter la productivité du système, comme l’ont montré Nabergoj et al. (2018a) où une productivité maximale de 109 phages mL-1 h-1 a été atteinte avec un faible taux de dilution de 2 h-1 dans un système cellstat de 1 L. Un système à fonctionnement continu peut être opérationnel en permanence, et constitue donc le moyen le plus pratique de produire un produit biotechnologique pour une entreprise. Cependant, ils sont difficiles et coûteux à mettre en œuvre et nécessitent une surveillance constante pour maintenir l’état d’équilibre. Un processus totalement continu de croissance bactérienne et de production de bactériophages pourrait augmenter la probabilité d’apparition d’une résistance aux bactériophages si des contre-mesures spécifiques ne sont pas adoptées (Middelboe et al., 2001).

Certains auteurs ont suggéré la mise en œuvre de processus en deux étapes, une exclusivement pour la production de bactéries et une seconde pour la propagation des phages (Schwienhorst et al., 1996 ; Sauvageau et Cooper, 2010 ; Nabergoj et al., 2018a). Ceci peut être réalisé avec un système cellstat, où deux bioréacteurs sont connectés en série avec un flux constant à travers le système. Dans ce cas, le débit entre les réacteurs et le volume dans chaque réacteur (ainsi que le taux de dilution et le taux de croissance bactérienne par addition) peuvent être contrôlés afin d’atteindre une productivité maximale (Nabergoj et al., 2018a). Une autre configuration intéressante proposée par Sauvageau et Cooper (2010) consiste en un système semi-continu d’un processus auto-cyclant à deux étapes. Dans ce cas, chaque étape fonctionne de manière similaire à une culture en lots, où les bactéries sont d’abord cultivées séparément des phages, puis introduites dans l’étape de propagation des phages lorsqu’une concentration appropriée est atteinte, ce qui permet de lancer le processus d’infection en utilisant une multiplicité d’infection souhaitée (Kasman et al., 2002). Cette configuration présente également l’avantage de ne pas nécessiter de surveillance permanente pour maintenir l’état stable des systèmes continus, et a été utilisée pour obtenir une productivité de 7,59 × 1014 UFP mol CO2-1 (Sauvageau et Cooper, 2010). Les deux exemples, le système cellstat et le processus d’autocyclage en deux étapes, ont le grand avantage que les bactéries sont cultivées en l’absence de phages, donc la résistance aux bactériophages n’est pas favorisée pendant le processus.

Enfin, est important de noter qu’il y a certains paramètres qui ne sont pas toujours rapportés dans les études sur la production de bactériophages. Par exemple, des paramètres tels que la proportion d’aération ou l’entrée d’air dans le bioréacteur ne sont mentionnés que dans deux rapports (Sauvageau et Cooper, 2010 ; Santos et al., 2014), alors qu’il s’agit de l’un des paramètres les plus importants dans la production de bactéries au niveau industriel. Les informations sur d’autres paramètres tels que le transfert d’énergie, les différentes utilisations du substrat, la conception du bioréacteur, l’agitation, les hélices et les matériaux de construction dans la production de bactériophages sont rares ou inexistantes.

Conclusion finale

La redécouverte de l’utilisation potentielle des phages dans un large spectre d’applications est très excitante et prometteuse. Les données suggèrent qu’il faut privilégier les systèmes de production de bactériophages qui réduisent la probabilité d’apparition d’une résistance aux bactériophages, comme un cellstat ou un processus d’autocyclage en deux étapes. Ces options permettraient également de contrôler les variables pour augmenter la productivité du processus. Néanmoins, les modèles de production de bactériophages sont loin d’être établis et peuvent être améliorés de plusieurs façons. Il reste encore de nombreux défis à relever. Des études supplémentaires sur la production optimisée de bactériophages à grande échelle, les coûts d’infrastructure et d’équipement, les différentes préoccupations en matière de sécurité et le dosage des applications sont nécessaires, et l’expérience suggère que ces défis devraient être relevés avec des efforts de collaboration des partenaires universitaires et industriels.

Enfin, il est important de noter que la plupart des modèles de production de bactériophages peuvent être appliqués dans une gamme spécifique de valeurs pour les paramètres de l’infection par les phages et de la croissance bactérienne. Par conséquent, indépendamment des avancées importantes dans les modèles et les configurations de production de phages, la connaissance approfondie du système spécifique phage-bactérie sera toujours la première exigence pour établir un système de production de phages efficace.

Contributions des auteurs

RG, SL, et RB ont conçu le travail et écrit le manuscrit. KG, GH, et JR ont rédigé les sections du manuscrit. Tous les auteurs ont contribué à la révision bibliographique, à la révision du manuscrit, ont lu et approuvé la version soumise.

Funding

Ce travail a été financé par le CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 et Postdoctorado PUCV 2018.

Déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

RG remercie CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL remercie Postdoctorado PUCV 2018.

.