Frontiers in Oncology

Introduction

Les gliomes sont les tumeurs intracrâniennes les plus courantes représentant environ 70% de toutes les tumeurs cérébrales primaires (1, 2). Il est bien connu que la résection totale est corrélée à une amélioration de la survie sans progression et globale chez les patients atteints de gliomes de bas grade (LGG) (3-6). Ainsi, la résection maximale sûre des LGG est considérée de nos jours comme le traitement primaire recommandé pour retarder une éventuelle transformation maligne (7, 8). Cependant, cette résection maximale sûre n’est réalisée que dans la minorité des LGG en raison de leur croissance infiltrante et de leurs frontières indéfinies (9).

La chirurgie utilisant la fluorescence de la protoporphyrine IX (PpIX) induite par l’acide 5-aminolévulinique (ALA) a été introduite dans le domaine neurochirurgical pour améliorer la visualisation peropératoire des tumeurs (10). Au cours des deux dernières décennies, ces résections guidées par fluorescence ont été particulièrement appliquées pour optimiser la chirurgie des gliomes de haut grade (HGG) (11). En ce sens, la chirurgie guidée par fluorescence au 5-ALA entraîne une fréquence significativement plus élevée de résections complètes et une survie sans progression prolongée dans les HGG (12-17). Ces dernières années, le 5-ALA a également été de plus en plus étudié lors de la chirurgie des LGG radiologiquement suspectés (3, 7, 11, 13, 18-21). D’après les données de ces premières études cliniques, la fluorescence induite par le 5-ALA est un marqueur puissant pour identifier les régions potentielles de transformation maligne (foyers anaplasiques) pendant la chirurgie des LGG suspectés et ainsi éviter les déclassements histopathologiques. Cependant, la majorité des LGG purs ne peuvent pas être visualisés par fluorescence visible selon la littérature actuelle (3, 7, 11, 13, 18, 19, 21, 22).

Les mécanismes exacts d’accumulation de PpIX et donc la présence ou l’absence de fluorescence visible induite par le 5-ALA dans les gliomes ne sont toujours pas clairs. Une grande variété de facteurs ont été suspectés d’influencer la fluorescence visible du 5-ALA, tels que l’augmentation du métabolisme et la régulation à la hausse des enzymes productrices de porphyrine (23), la réduction du métabolisme du fer au sein des cellules néoplasiques (24) et la réduction de l’activité de l’enzyme ferrochélatase qui convertit le PpIX fluorescent en hème (25). Récemment, une étude in vitro a montré que les médicaments antiépileptiques (AED) provoquent une lésion de la membrane mitochondriale et conduisent ainsi à l’inhibition de la synthèse de PpIX dans les cellules de gliome (26). De nos jours, les AED sont fréquemment administrés aux patients souffrant de LGG avant la chirurgie. Nous émettons l’hypothèse que l’administration des AED pourrait influencer la présence de fluorescence visible dans les LGG pendant la résection chirurgicale.

Le but de la présente étude était donc d’étudier le rôle de la fluorescence induite par le 5-ALA dans la chirurgie des LGG et d’analyser l’influence des AED sur la présence de fluorescence visible.

Matériels et méthodes

Population de patients

Les patients qui ont subi une résection d’un LGG suspecté nouvellement diagnostiqué à l’Institut neurochirurgical Burdenko après l’administration de 5-ALA entre mars 2014 et mars 2016 ont été recrutés. Dans notre étude, au total, 27 patients présentant un LGG confirmé par histopathologie ont finalement été inclus. Notre cohorte d’étude comprenait 19 hommes et huit femmes avec un âge médian de 33 ans (fourchette : 18-66 ans). D’après notre analyse histopathologique, 14 astrocytomes diffus, 6 oligodendrogliomes, 4 astrocytomes pilocytaires, 2 astrocytomes gemistocytaires et un gangliogliome infantile desmoplastique ont été diagnostiqués. L’application de 5-ALA pendant la chirurgie a été possible chez les 27 patients. Aucun de nos patients n’a présenté d’effets secondaires significatifs liés au 5-ALA dans notre étude. Le consentement éclairé pour la procédure chirurgicale et l’administration du 5-ALA a été obtenu de tous les patients. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique local du Centre national de recherche médicale de neurochirurgie N. N. Burdenko (Moscou, Russie).

Critères d’inclusion et d’exclusion

Les critères d’inclusion pour le recrutement dans cette étude étaient un âge ≥18 ans, un LGG suspecté par IRM, une possible résection totale brute (RTG) (c’est-à-dire, >90%) selon l’estimation chirurgicale préopératoire, absence d’antécédents connus de maladie hépatique ou de signes de dysfonctionnement hépatique significatif et échelle de Karnofsky ≥70. Les critères d’exclusion pour l’administration de 5-ALA étaient les antécédents de photosensibilité, les antécédents de porphyrie du patient ou de sa famille, la grossesse et l’allaitement. Seuls les patients avec un diagnostic de LGG après la chirurgie sont restés dans la cohorte finale de l’étude.

Procédure chirurgicale

Les patients ont reçu par voie orale 25 mg/kg de poids corporel de 5-ALA (« Alasence » NIOPIK, Moscou, Russie) dissous dans 100 ml d’eau ~3 h avant la chirurgie. En fonction de la localisation de la tumeur, une surveillance neurologique peropératoire avec des potentiels évoqués sensori-moteurs et/ou une stimulation directe (Viking Select, Nicolet ; n = 21 patients) ainsi qu’une chirurgie éveillée (n = 2 patients) ont été réalisées. Un microscope neurochirurgical modifié (Carl Zeiss OPMI Pentero, Allemagne) équipé d’un module de lumière UV fluorescente de 400 nm et de filtres spécifiques a été utilisé. L’ablation microchirurgicale de la tumeur a été réalisée en utilisant principalement la microscopie à lumière blanche standard avec l’aide de la neuronavigation dans la plupart des cas (n = 20 patients). Pendant l’opération, le microscope a été commuté à plusieurs reprises sur la lumière d’excitation bleu-violet pour visualiser la fluorescence potentielle.

L’intensité de la fluorescence a été évaluée visuellement par un chirurgien et déterminée comme « faible » avec seulement une petite partie de la tumeur montrant une fluorescence rose avec son gros ne fluorescent pas du tout, « modérée » avec plus de la moitié de la tumeur révélant une fluorescence rose, et « brillante » avec la majeure partie de la tumeur apparaissant rouge vif. La fluorescence assistée par spectroscopie a été évaluée quantitativement chez 12 patients. Le niveau de fluorescence variait de 0 à 15 unités arbitraires (après normalisation des données) par rapport au cerveau intact. Nous n’avons pas spécialement mis en évidence le rôle de la spectroscopie, car elle n’a été réalisée que chez certains de nos patients. En outre, nous avons également déterminé l’homogénéité de la fluorescence intratumorale de chaque tumeur. En ce sens, la fluorescence diffuse a été définie comme une fluorescence homogène de l’ensemble de la tumeur. En revanche, la fluorescence focale a été définie comme une zone circonscrite de fluorescence au sein d’une tumeur autrement non fluorescente. Au cours de la chirurgie, des échantillons de tissus provenant de zones fluorescentes et/ou non fluorescentes au sein de la tumeur et/ou de la bordure supposée de la tumeur ont ensuite été prélevés pour une analyse histopathologique. Pour éviter une phototoxicité potentielle liée au 5-ALA, tous les patients ont été protégés des sources lumineuses fortes pendant au moins 24 h après l’administration du médicament.

Histopathologie

Tous les échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine ont été traités pour une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E). Le diagnostic de la tumeur a été établi par un neuropathologiste expérimenté selon les critères histopathologiques actuels de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) (27). Dans notre étude, la densité cellulaire et le taux de prolifération (indice de marquage Ki-67) ont été étudiés dans chacun des échantillons de tissus collectés.

Préparation de la prise d’AED

Comme l’objectif principal de notre étude était d’étudier l’influence potentielle des AED sur la fluorescence induite par le 5-ALA, nous avons documenté chez chaque patient si des AED ont été administrés avant la chirurgie (oui ou non). Les patients ont ingéré des doses moyennes de DEA : acide valproïque (jusqu’à 1,5 mg par jour), levetiracetam (800 mg par jour). Nous n’avons pas étudié chaque médicament séparément, car la série générale n’était pas importante.

Cours postopératoire

L’état neurologique de chaque patient a été examiné avant et après la chirurgie pour détecter une éventuelle détérioration postopératoire des symptômes neurologiques. En outre, l’étendue de la résection a été jugée en fonction des résultats d’une IRM postopératoire précoce (jusqu’à 72 heures après l’opération) : (1) une RTG était présente si au moins 90 % de la masse tumorale était enlevée, (2) une résection subtotale si plus de 50 % de la masse tumorale était réséquée, et (3) une résection partielle si <50 % de la tumeur était enlevée.

Analyse statistique

Le traitement des données a été effectué à l’aide du logiciel R de calcul statistique (version 3.4.4). Les variables continues ont été comparées dans les groupes à l’aide du test U de Mann-Whitney. Pour analyser la relation entre les variables catégorielles, un test exact de Fisher a été appliqué. Une analyse de régression logistique a été effectuée pour ajuster les facteurs de confusion lors de l’évaluation de l’effet du DEA sur la fluorescence. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs pour p < 0,05.

Résultats

Fluorescence induite par le 5-ALA et diagnostic histopathologique

Nous avons observé une fluorescence visible pendant la chirurgie dans 14 (52%) des 27 cas, alors qu’aucune fluorescence n’a été détectée dans les 13 autres cas (48%).

Selon le diagnostic histopathologique de la tumeur, les 4 astrocytomes pilocytaires, les 2 astrocytomes gémistocytaires et le seul gangliogliome infantile desmoplastique présentaient une fluorescence visible. De plus, une fluorescence visible a été trouvée dans 4 (29%) des 14 astrocytomes diffus, et 3 (50%) des 6 oligodendrogliomes. Selon l’homogénéité de la fluorescence intratumorale (n = 14 cas), 7 tumeurs avaient une fluorescence visible « diffuse », tandis que les 7 autres gliomes avaient des sites « focaux » de fluorescence visible. Les détails sur les données de fluorescence de notre cohorte sont fournis dans le tableau 1 et les cas illustratifs dans la figure 1.

Fluorescence induite par le 5-ALA et paramètres histologiques

Au total, 80 échantillons de tissus ont été collectés pendant la chirurgie des 27 patients (médiane : 3 échantillons ; plage de 1 à 12 échantillons par patient). Parmi ceux-ci, une fluorescence visible a été trouvée dans 21 échantillons (26%), tandis que 59 échantillons (74%) ne présentaient aucune fluorescence visible. La densité cellulaire était significativement plus élevée dans les échantillons positifs à la fluorescence (2 180 mm2) que dans les échantillons négatifs à la fluorescence (1 510 mm2 ; p = 0,03). De plus, le taux de prolifération évalué par l’indice de marquage Ki-67 était également significativement plus élevé dans les échantillons positifs à la fluorescence (2,52 %) que dans les échantillons négatifs à la fluorescence (0,41 % ; p = 0,04).

Fluorescence induite par le 5-ALA et AED

En raison d’antécédents de crises préopératoires, 15 patients (56%) de notre cohorte d’étude prenaient des AED avant la chirurgie (finlepsin, levetiracetam, trileptal, et/ou acide valproïde). Parmi les 15 patients ayant pris des AED avant l’opération, 11 patients (73%) n’ont montré aucune fluorescence visible pendant la résection. En revanche, 10 (83 %) des 12 patients restants sans prise préalable de DEA ont montré une fluorescence visible. Ainsi, la fluorescence visible était significativement plus fréquente chez les patients sans prise de DEA que chez les patients avec prise de DEA préopératoire. L’AED s’est avéré être un facteur significatif (p = 0,048) influençant la probabilité de fluorescence peropératoire lorsqu’il a été ajusté pour d’autres facteurs de confusion potentiels (astrocytome/non-astrocytome, localisation frontale, dose de dexaméthasone) dans un modèle de régression logistique. Les autres facteurs inclus dans le modèle n’ont pas montré de relation significative avec la fluorescence (p > 0,05).

Cours postopératoire

Après la chirurgie, 21 patients ont présenté des symptômes neurologiques stables et quatre patients se sont améliorés. En revanche, une détérioration des symptômes neurologiques a été constatée chez les deux patients restants. Selon l’IRM postopératoire précoce, une résection totale macroscopique a été réalisée chez 16 patients (59%), une résection subtotale chez 8 patients (30%), et une résection partielle chez trois patients (11%). La fluorescence n’a pas été corrélée avec l’étendue de la résection.

Discussion

L’utilisation de la fluorescence induite par le 5-ALA devient de plus en plus populaire dans le but de maximiser l’étendue de la résection notamment dans les HGG et ainsi améliorer le pronostic postopératoire des patients. Dans ce sens, la chirurgie guidée par la fluorescence a démontré qu’elle améliorait significativement le taux de résections complètes dans les HGG par rapport à la microchirurgie seule, et cette technique innovante a également presque doublé la survie sans progression à 6 mois (16). Récemment, une fluorescence PpIX visible a également été trouvée dans d’autres lésions cérébrales telles que les méningiomes (19), et les tumeurs métastatiques (18, 28).

Littérature actuelle : Fluorescence du 5-ALA dans le LGG

Jusqu’à présent, la valeur de la fluorescence induite par le 5-ALA dans le LGG n’a été étudiée que dans quelques études. Dans ce sens, Ishihara et al. ont décrit pour la première fois en 2007 l’application du 5-ALA dans deux LGG et n’ont pas trouvé de fluorescence visible dans les multiples échantillons de tissus collectés (29). De plus, Ruge et al. ont publié en 2009 un rapport de cas d’une fille de 9 ans qui a subi une résection guidée par fluorescence d’un xanthoastrocytome pléomorphe du lobe temporal droit et ont détecté une fluorescence visible de la tumeur (20). De plus, Stockhammer et al. ont publié en 2009 un rapport de cas d’un astrocytome diffus de grade OMS II avec une densité cellulaire modérée, une densité microvasculaire plus élevée et une fluorescence visible (30). Des cas de fluorescence d’astrocytome pilomyxoïde et d’astrocytome pilocytique ont été publiés par Bernal Garcia et al. (31) et Choo et al. (32), respectivement. La première série de patients atteints de LGG et de 5-ALA a été publiée par Widhalm et al. (33). Dans cette étude, les huit gliomes de grade II de l’OMS infiltrés de manière diffuse n’ont pas montré de fluorescence visible induite par le 5-ALA pendant la chirurgie. Dans une autre étude, Ewelt et al. ont rapporté en 2011 une fluorescence visible dans seulement un (8%) des 13 LGGs pendant la chirurgie (7). Trois ans après la première série de patients, Widhalm et al. ont publié une série plus importante en 2013 et ont trouvé une fluorescence visible dans 4 (9%) des 33 LGG (34). Dans une autre étude de Marbacher et al, 8 (40 %) des 20 LGG présentaient une fluorescence visible (18). En 2015, Valdes a fondé la fluorescence visible dans 4 (33%) des 12 LGGs analysés (35). Enfin, Jaber et al ont trouvé en 2016 dans la plus grande série à ce jour une fluorescence visible dans 13 (16%) des 82 LGGs (36). Ainsi, selon la littérature actuelle, la fluorescence visible n’est observée que chez une minorité de patients atteints de LGG.

Étude actuelle : Fluorescence du 5-ALA dans les LGG

Malgré ces autres études disponibles dans la littérature actuelle, nos données ont montré la présence d’une fluorescence visible dans plus de la moitié de nos cas pendant la chirurgie. Une explication possible du taux plus élevé de LGGs avec fluorescence visible par rapport à la littérature actuelle pourrait être que nous avons utilisé une dose légèrement plus élevée de 5-ALA (25 mg/kg de poids corporel) par rapport aux autres études (18, 33, 34). Cependant, Stummer et al. ont comparé différentes doses de 5-ALA dans la chirurgie du gliome malin (0,2, 2, 20 mg/kg) et ont conclu que l’utilisation de doses de 5-ALA supérieures à 20 mg/kg de poids corporel n’entraînerait probablement pas une amélioration de l’effet de fluorescence (37). Une autre explication pourrait être que nous avons également inclus d’autres entités tumorales en dehors des gliomes à infiltration diffuse, comme les astrocytomes pilocytiques ou un gangliogliome. Nos résultats prometteurs doivent cependant être confirmés dans des études multicentriques indépendantes incluant une plus grande cohorte de patients souffrant de LGG.

Intéressant, nous avons bien observé une fluorescence visible non seulement dans des zones intratumorales focales comme décrit précédemment (33, 34), mais aussi une fluorescence diffuse avec un éclat homogène de la tumeur entière. Nous supposons que la présence de fluorescence visible focale dans le LGG pourrait représenter des zones de transformation maligne potentielle future. En outre, les études futures devraient clarifier si l’étendue de la résection pourrait être optimisée en particulier dans les LGG avec un modèle de fluorescence diffuse.

5-ALA Fluorescence et Histopathologie

Dans notre étude, nous avons observé des niveaux significativement plus élevés de densité cellulaire et de prolifération dans les échantillons avec fluorescence visible par rapport à l’absence de fluorescence. Ceci est en accord avec les deux études précédentes de Widhalm et al (33, 34). De même, Widhalm et al ont trouvé un taux de mitose, une densité cellulaire et un pléomorphisme nucléaire significativement plus élevés dans les échantillons fluorescents par rapport aux échantillons non fluorescents. De plus, l’indice de prolifération évalué par MIB-1 LI était significativement plus élevé dans les échantillons présentant une fluorescence visible par rapport aux échantillons non fluorescents. En ce sens, ces données précédentes indiquent que la fluorescence visible est capable d’identifier les foyers anaplasiques selon les critères histopathologiques de l’OMS (33, 34). Comme nous avons également trouvé une densité cellulaire et un taux de prolifération significativement plus élevés dans les zones de fluorescence visible dans une série de LGG, nous pensons que le 5-ALA pourrait servir de marqueur précoce de la transformation maligne en cours d’un LGG initial. De futures études avec des données suffisantes sur le suivi sont nécessaires pour clarifier cette question importante.

Fluorescence du 5-ALA et AEDs

De nos jours, il est courant que les patients atteints de LGG aient un traitement médical des crises épileptiques (38-40). Hefti et al. ont démontré dans une étude in-vitro que la synthèse de PpIX était réduite jusqu’à 45% dans les cellules de gliome sous l’effet de la phénytoïne, mais pas du lévétiracétam (26). Dans notre étude, nous avons constaté que la fluorescence visible était significativement plus fréquente chez les patients sans prise de DEA que chez les patients avec prise de DEA préopératoire (r = 0,56 ; p = 0,045). Sur les 15 patients avec prise préopératoire de DEA, 11 patients (73%) n’ont pas montré de fluorescence visible pendant la résection. En revanche, 10 (83 %) des 12 patients restants sans prise préalable de DEA ont montré une fluorescence visible. Les mécanismes sous-jacents de l’influence observée des AED sur la fluorescence visible ne sont pas encore clairs. L’influence des AED sur les activités de l’acide 5-aminolévulinique déshydrase et de l’uroporphyrinogène I synthétase dans les érythrocytes d’un garçon épileptique déficient en vitamine B6 à qui l’on avait administré de l’acide valproïque et de la carbamazépine a également été décrite par Haust et al. de l’Université de Western Ontario, Canada en 1989 (41). Une hypothèse possible est que les AED ont une influence sur les enzymes de la synthèse de PpIX dans les mitochondries des cellules de gliome et résultent ainsi en la présence ou l’absence de fluorescence dans le LGG. Une autre étude sur des lignées cellulaires de glioblastome a révélé que les AED (phénytoïne/valproates) et la dexaméthasone peuvent inhiber la synthèse de PpIX (10). Les mécanismes exacts de l’influence des AED sur la fluorescence visible doivent être clarifiés dans des études futures.

Directives futures

À l’avenir, nos premières observations devraient être confirmées dans d’autres études indépendantes avec une grande cohorte de patients. De telles études plus importantes offrent également la possibilité d’analyser l’influence des différents types de DEA séparément. De plus, l’influence des AEDs devrait également être étudiée dans les HGGs. En cas d’absence de fluorescence visuelle, des méthodes de détection quantitative pourraient être utiles pour améliorer la visualisation du tissu LGG. En ce sens, la microscopie confocale est également un outil puissant pour visualiser la fluorescence tumorale cellulaire induite par le 5-ALA dans les LGG et à l’interface cerveau-tumeur (21). Cependant, des données convaincantes de la microscopie confocale dans une grande cohorte de patients atteints de LGG manquent encore à ce jour. Une autre méthode représente l’analyse spectroscopique de l’accumulation de PpIX avec des sondes spécifiques. Par cette approche, Valdes et al. ont découvert que l’accumulation de PpIX peut être détectée quantitativement malgré la faible précision diagnostique de la fluorescence visuelle dans les LGG (35, 42). Par conséquent, cette approche prometteuse mérite d’être approfondie dans de futures études.

Conclusions

Dans la présente étude, nous avons examiné le rôle du 5-ALA dans les LGG et l’influence des médicaments antiépileptiques sur la fluorescence peropératoire. D’après nos données, nous avons observé un taux de fluorescence visible nettement plus élevé dans notre série de LGGs (52%) par rapport à la littérature actuelle. De plus, une densité cellulaire et une prolifération accrues ont été notées dans les zones de fluorescence visible. Ainsi, la fluorescence induite par le 5-ALA pourrait également améliorer la visualisation peropératoire d’un sous-groupe de LGG et pourrait également être un marqueur utile pour la détection optimisée de l’hétérogénéité histopathologique pendant la chirurgie des LGG. De plus, la prise préopératoire d’AEDs semble réduire la présence de fluorescence visible dans ces tumeurs selon nos données préliminaires et donc cette question devrait être prise en compte dans le cadre clinique. De plus, des études multicentriques indépendantes incluant une plus grande cohorte de patients LGG sont nécessaires pour confirmer les données prometteuses de cette présente étude.

Limitations

Nous comprenons que l’analyse des facteurs influençant la Fluorescence doit être multiple. Pour y parvenir, nous avons utilisé le modèle de régression logistique. L’AED s’est avéré être un facteur significatif influençant la probabilité de fluorescence peropératoire, après ajustement pour d’autres facteurs de confusion potentiels (astrocytome/non-astrocytome, localisation frontale, dose de dexaméthasone, mutation IDH1) dans un modèle de régression logistique. La densité cellulaire et l’indice Ki67 n’ont été révélés que chez les patients ayant subi plusieurs biopsies (10 patients). Il a été conclu que la densité cellulaire et l’indice Ki67 étaient plus élevés pour les échantillons de biopsie prélevés dans la zone fluorescente que dans la zone non fluorescente. Nous avons peu de preuves de la densité cellulaire pour les 17 autres patients, leur indice Ki67 représentant principalement 4-5%. Comme il s’agit d’une analyse rétrospective portant sur 27 patients, nous n’avions pas prévu d’étudier la densité cellulaire et l’indice Ki67. Malheureusement, nous n’avons pas d’ensemble de données complet pour Ki67 et la densité cellulaire à inclure dans un modèle de régression logistique.

Déclaration éthique

Cette étude a été réalisée comité local du Centre national de recherche médicale de neurochirurgie N. N. Burdenko (Moscou, Russie) avec le consentement éclairé écrit de tous les sujets. Tous les sujets ont donné leur consentement éclairé par écrit, conformément à la Déclaration d’Helsinki. Le protocole a été approuvé par le comité local du Centre national de recherche médicale de neurochirurgie N. N. Burdenko (Moscou, Russie).

Contributions des auteurs

SG, GW et AP ont conçu l’étude. LS, VJ, et MR ont collecté les données. TS, VL, GP, et AR ont réglé les détails techniques. MG et DC ont analysé les données et rédigé l’article avec la contribution de tous les auteurs. AS et AP ont édité le texte. KC a analysé les données et rédigé le texte avec la contribution de tous les auteurs.

Funding

L’étude rapportée a été financée par RFBR selon les projets de recherche n°17-00-00158, n°17-00-00159, et 17-00-00157 .

Déclaration de conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Nous souhaitons remercier l’aide fournie par nos collègues : Danilov G. V., MD, Ph.D., N. N. Burdenko Scientific Research Neurosurgery Institute, Moscou, Russie pour le soutien statistique.

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