Procédures d’expression protéique, de purification et de dosage de hAASS-SDH
Vecteur : pFB-LIC-Bse
Ligne cellulaire : DH10Bac
Tags et ajouts : N-terminal, étiquette hexahistidine clivable par la protéase TEV
Construire la séquence de la protéine :
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(la séquence soulignée contient le vecteur codé His-codée par vecteur et le site de clivage de la protéase TEV*)
Les cellules récoltées ont été remises en suspension dans un tampon de lyse (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycérol, 20 mM Imidazole pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL par 1 mL de cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA).
Le culot cellulaire a été dissous dans environ 200 mL de tampon de lyse et brisé par homogénéisation par 2 passages à 12 000 psi. Les débris cellulaires ont été granulés à 35000 x g, 1h et le surnageant utilisé pour la purification sur une colonne Ni-NTA à écoulement par gravité (5 mL).
Les tampons utilisés sont détaillés ci-après;
Tampon de liaison : 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glycérol, 20 mM Imidazole pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Tampon de lavage : 50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glycérol, 40 mM Imidazole pH 7.4, 0.5 mM TCEP
Tampon d’élution : 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glycérol, 250 mM Imidazole pH 7,4, 0,5 mM TCEP
L’extrait cellulaire clarifié a été ajouté à 5 ml de résine Ni-NTA pré-équilibrée avec du tampon de lyse et passé à travers une colonne en verre. La colonne a ensuite été lavée avec du tampon de liaison (2 x 50 ml) et du tampon de lavage (2 x 50 ml). La protéine a été éluée avec le tampon d’élution dans des fractions de 5 x 5 mL. Les fractions éluées de la colonne 1 ont été regroupées et concentrées jusqu’à 5 ml avec un concentrateur de spin de 30 kDa MWCO et injectées dans une colonne S200 16/60 (pré-équilibrée dans du tampon GF (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 5% Glycérol)) à 1.0 ml/min. Des fractions de 1,5 mL ont été recueillies. La protéine éluée a été clivée pendant la nuit à 4 °C par la protéase TEV (1/20 (p/p)). Le jour suivant, l’échantillon de protéines a été chargé sur une colonne de Ni-sepharose de 0,5 ml prééquilibrée avec du tampon GF pour éliminer les protéines non clivées. Les fractions protéiques regroupées ont été concentrées à 13 mg/mL à l’aide d’un concentrateur mwco 30 kDa.
Dosage d’activité et criblage
L’activité SDH de hAASS a été mesurée en suivant la réduction du NAD+ en NADH, en profitant du fait que la forme réduite du NADH est fluorescente lorsqu’elle est excitée par une lumière de 340 nm. Nous avons adopté le test en format 384 puits, avec détection à l’aide du lecteur de fluorescence PheraStar (BMG Labtech) (Excitation/Emission = 340/480 nm). Ce test a donné une réponse linéaire avec une concentration de protéines jusqu’à 150 nM. Une réaction typique consiste en 100 nM d’enzyme purifiée, 0,2 mM de NAD+, 1,3 mM de saccharopine. Le tampon de réaction est constitué de 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% CHAPS. Les bibliothèques de composés (LOPAC (Sigma) et NIH Clinical Collections I&II) ont été criblées en interne à une concentration de composés de 20 μM.
La fluorimétrie à balayage différentiel
DSF a été réalisée dans une plaque de 96 puits à l’aide d’une machine RT-PCR Mx3005p (Stratagene) avec des filtres d’excitation et d’émission de 492 et 610 nm, respectivement. Chaque puits contenait 2 µl de protéine dans un tampon DSF 2 µM (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µl de SYPRO ORANGE dilué 1000 fois dans le tampon DSF à partir du stock du fabricant (Invitrogen), et (le cas échéant) 2 µl de ligand à différentes concentrations. Les intensités de fluorescence ont été mesurées de 25 à 96°C avec une vitesse de rampe de 3°C/min.
Cristallisation
Des cristaux d’Apo ont été préparés en mélangeant 50 nL de protéine hAASS-SDH (80 mg/mL) avec 100 nL de solution réservoir contenant 20% de PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 et 0,2-0,33 M de malonate de sodium. Des cristaux liés au NAD+ ont été préparés en mélangeant 100 nL de hAASS-SDH (18 mg/mL, en excès molaire de NAD+) avec 50 nL de solution réservoir contenant 25% PEG3350, 0,2M NaCl et 0,1M tris pH 8,5. Les cristaux ont été cryoprotégés dans du butanediol à 9% avant d’être congelés dans l’azote liquide. Pour la campagne de criblage de fragments, les cristaux ont été immergés avec des composés (10/50/500 mM) dans la solution de cristallisation complétée par du butanediol à 8% pendant 5 à 30 min, puis congelés dans l’azote liquide.
Procédures de détermination de la structure
Les cristaux de hAASS-SDH apo et liés au NAD+ appartiennent à des groupes spatiaux différents (P43212 vs P212121). La structure de hAASS-SDH a été résolue par remplacement moléculaire avec le programme PHASER, en utilisant la saccharopine réductase fongique de S.cerevisiae (code PDB 2AXQ) comme modèle de recherche (38% d’identité de séquence). Deux molécules ont été trouvées dans l’unité asymétrique (u.a.). Le modèle initial a été reconstruit en utilisant phenix.autobuild. Une molécule de NAD+ liée dans le site actif a été identifiée par la méthode de différence de Fourier et placée manuellement dans la densité électronique en utilisant Coot. Pour compléter le modèle, des cycles itératifs de phenix.refine incluant un raffinement TLS suivi d’une construction manuelle du modèle pour les résidus manquants en utilisant Coot ont été effectués. Aucune contrainte NCS n’a été appliquée en raison des différences de conformation dans le domaine III (res 278-376) des deux copies dans l’u.a. Les atomes de solvant ont été placés pendant les quatre derniers cycles de raffinement en utilisant phenix.refine. Pour la campagne de criblage de fragments, les ligands ont été identifiés par DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) en utilisant des cartes de densité de différence. Les liants plus faibles avec une faible occupation ont été évalués en utilisant PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), basé sur des modèles statistiques pour trouver la densité de ligands présents dans un ensemble de données donné qui n’est pas présent dans la majorité des ensembles de données. Les coordonnées et les facteurs de structure de tous les ensembles de données sont déposés dans la Banque de données sur les protéines de la RCSB. La collecte des données et les statistiques de raffinement sont disponibles sur les pages PDB.
Réactifs disponibles commercialement
Plasmides knockoutCRISPR/Cas9
SCBT : Cat # sc-406408
Genscript : Cat # 10157
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