Survie cellulaire après irradiation
L’étude de la croissance et de la mort cellulaire induite par le rayonnement, définie comme la période de temps requise pour une perte complète de la capacité de prolifération ou une exaltation de la capacité de prolifération, est l’une des méthodes les plus couramment et fiablement utilisées pour étudier les effets des radiations sur les cellules. Pour les expériences d’irradiation, notre laboratoire a vérifié que les lectures du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) étaient proportionnelles au nombre de cellules in vitro, au moins dans la phase de croissance exponentielle (données non présentées). L’irradiation par des ions 12C6+ à haute énergie entraîne généralement la mort de la grande majorité des cellules. La fraction de la mort cellulaire dans la phase de latence après l’irradiation et les changements dans le temps de doublement peuvent être mesurés en effectuant des analyses à différents moments après l’irradiation. Comme notre test n’était pas seulement une détermination de la survie en un seul point, des informations sur les performances de croissance ont également pu être acquises facilement. La courbe de survie a été tracée sur une échelle logarithmique naturelle de la fraction de survie en fonction de différents paramètres physiques.
Les cellules de C. tyrobutyricum 25755 ont été irradiées 20 h après l’ensemencement. Les souches présentant l’activité métabolique la plus faible et la prolifération la plus lente ou les cellules qui ont cessé de proliférer ont été exclues du test par lavage et trypsinisation lorsque l’ensemencement a été effectué après l’irradiation. La fraction de survie obtenue à partir de l’équation (1) a été comparée à un ensemble représentatif de données expérimentales. La figure 1 montre une comparaison des courbes de survie après irradiation par ions 12C6+ à différentes énergies de faisceau pour les diverses souches de C. tyrobutyricum ATCC 25755. Les résultats du test MTT sont tracés en fonction de la dose d’irradiation (10 à 50 Gy) à 68 AMeV d’énergie et 106 à 108 ions – niveaux d’impulsion-1, qui étaient e0 → e-4,5 pour la figure 1A, e0 → e-5,8 pour la figure 1B et e0 → 0 pour la figure 1C. Les figures 1D-F présentent les données de survie cellulaire issues des résultats du test MTT en fonction de la dose d’irradiation (10 à 50 Gy) à 114 AMeV d’énergie et 106 à 108 de niveaux d’ions-pulse-1, qui étaient e0 → 0. En général, un accord suffisant entre les calculs et les données expérimentales a été obtenu. Pour les souches traitées à 68 AMeV, l’équation a sous-estimé l’efficacité de la dose, tandis que pour les cellules irradiées à des énergies élevées (114 AMeV), le résultat a été surestimé. L’écart maximal, dérivé du rapport entre les doses calculées et mesurées pour un niveau d’effet donné, était de 15 %. La fraction de survie des souches dépendait fortement des caractéristiques physiques particulières du faisceau d’ions 12C6+, déterminées par les niveaux d’énergie, de dose et d’ions – impulsion-1 des particules considérées (figure 1). De toute évidence, la fraction de survie diminuait avec l’augmentation de l’énergie des ions carbone. Comme prévu, le logarithme de survie des essais a montré les mêmes caractéristiques : la survie dépendait de l’énergie, des ions-impulsion-1 et de la dose d’irradiation par ions 12C6+. L’augmentation d’un paramètre physique à la fois a conduit à une diminution du taux de survie. Une survie très limitée (e-3,5 → e-6,5) a été obtenue lorsque l’ion 12C6+ a été irradié en utilisant 114 AMeV d’énergie, une dose de 20 à 40 Gy et 106 à 108 ions-impulsion-1.
L’effet de l’irradiation par l’ion 12C6+ sur la survie de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. Les cellules ont été irradiées 20 h après l’ensemencement et le degré de survie a été déterminé par le test MTT. Les données de survie sont représentées en fonction des niveaux d’irradiation. (A-C) Les ions 12C6+ ont été accélérés jusqu’à 68 AMeV, et leurs ions/impulsion étaient compris entre 106 et 108, à un débit de dose de 10 à 50 Gy. (D-F) Les ions 12C6+ ont été accélérés jusqu’à 114 AMeV, et leurs ions/impulsion étaient compris entre 106 et 108, à un débit de dose de 10 à 50 Gy. Les cellules à faible activité métabolique et à prolifération lente ou les cellules qui cessent de proliférer ont été exclues de l’essai par lavage et trypsinisation lorsque l’ensemencement a été effectué après l’irradiation.
De nombreux types de cellules sont caractérisés par une division cellulaire régulière toutes les 12 à 24 h. En raison de la puissance de la croissance exponentielle, une seule cellule peut produire des milliers de cellules filles en environ 9 à 12 cycles de division normaux, soit quelques jours. Après irradiation, les survivants peuvent alors être composés de quelques mutants. Un très faible pourcentage des survivants de C. tyrobutyricum ATCC 25755 peut présenter une capacité améliorée à produire du butyrate.
Les effets de l’acide butyrique sur la croissance cellulaire après irradiation
C. tyrobutyricum ATCC 25755 utilise le glucose ou le xylose comme source de carbone et d’énergie. Le monosaccharide est transporté dans la cellule par un système d’absorption par phosphoénolpyruvate dépendant de la phosphotransférase. Ensuite, le glucose ou le xylose est métabolisé par la glycolyse, qui présente une dépendance insignifiante au pH dans la plage de pH 7 à pH 5,5. Cependant, les fermentations sont arrêtées lorsque le glucose ou le xylose n’est plus consommé par les cellules en raison de l’inhibition par le butyrate. Pour étudier plus en détail l’effet spécifique de l’irradiation sur les profils de croissance des cellules (sur la base des mesures de la densité optique (DO) de la suspension cellulaire à 600 nm), des cultures discontinues individuelles ont été effectuées dans un milieu P2 chimiquement défini (réalisé dans des bouteilles de sérum) contenant 42 g-L-1 de glucose et complété par 3,6, 7,2 et 10,8 g-L-1 d’acide butyrique. Le pH de la culture de C. tyrobutyricum ATCC 25755 (Figure 2A, contrôle) a chuté à environ 4,8 (ΔpH de 1,4, à partir de pH 6,2) par rapport à lorsqu’elle a été supplémentée avec 3,6 g-L-1 d’acide butyrique (Figure 2A1), 7.2 g-L-1 d’acide butyrique (Figure 2A2) et 10,8 g-L-1 d’acide butyrique (Figure 2A3), les valeurs de pH correspondantes étaient respectivement d’environ 6,0 (ΔpH de 0,5 à partir de 6,5), 6,1 (ΔpH de 0,3 à partir de 6,4) et 5,9 (ΔpH de 0,5 à partir de 6,4). Cependant, lorsque la culture a été irradiée avec 68 AMeV à une dose de 40 Gy (Figure 2D, contrôle), le pH a chuté à environ 4,8 (ΔpH de 1,7 à partir de 6,5) alors qu’à une dose de 40 Gy (complétée par 3,6 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2D1), une dose de 40 Gy (complétée par 7.2 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2D2) et une dose de 40 Gy (complétée par 10,8 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2D3), les valeurs de pH étaient respectivement d’environ 4,6 (ΔpH de 1,6 à partir de 6,2), 4,8 (ΔpH de 1,4 à partir de 6,2) et 5,9 (ΔpH de 0,3 à partir de 6,2). Lorsque la culture a été irradiée à 114 AMeV et à une dose de 40 Gy (Figure 2G, contrôle), le pH a chuté à environ 5,7 (ΔpH de 0,6 à partir de 6,3) alors qu’à une dose de 40 Gy (complétée par 3,6 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2G1), une dose de 40 Gy (complétée par 7.2 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2G2) et une dose de 40 Gy (complétée par 10,8 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2G3), les valeurs de pH étaient respectivement d’environ 5,7 (ΔpH de 0,6 à partir de 6,3), 5,4 (ΔpH de 0,9 à partir de 6,3) et 5,6 (ΔpH de 0,7 à partir de 6,3). Lorsque la culture a été irradiée à 68 AMeV et à une dose de 20 Gy (complétée par 7,2 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2B2), le pH a chuté à environ 4,4 (ΔpH de 0,9 à partir de 6,3) tandis qu’à une dose de 30 Gy (complétée par 7.2 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2C2) et une dose de 40 Gy (complétée par 7,2 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2D2), les valeurs de pH étaient respectivement d’environ 4,6 (ΔpH de 1,7 à partir de 6,3) et 4,8 (ΔpH de 1,5 à partir de 6,3). Lorsque la culture a été irradiée à 114 AMeV et à une dose de 40 Gy (complétée par 10,8 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2E3), le pH a diminué à 5,9 (ΔpH de 0,4 à partir de 6,3) tandis qu’à une dose de 30 Gy (complétée par 10,8 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2F3) et à une dose de 40 Gy (complétée par 10,8 g-L-1 d’acide butyrique) (Figure 2G3), les valeurs de pH étaient d’environ 6.0 (ΔpH de 0,3 à partir de 6,3) et 5,8 (ΔpH de 0,5 à partir de 6,3), respectivement.
Cours temporel des activités des cellules de type sauvage et irradiées en fonction des concentrations d’acide butyrique ajouté pendant les 54 premières heures de fermentation. (A) Croissance cellulaire des souches de type sauvage, non affectée par l’ajout de butyrate (cultures témoins). (B-D) Croissance cellulaire des souches irradiées (énergie 68 AMeV et doses de 20, 30 et 40 Gy), non affectée par l’ajout de butyrate (cultures témoins). (E,F) Croissance cellulaire des souches irradiées (énergie 114 AMeV et doses de 20, 30 et 40 Gy), non affectée par l’ajout de butyrate (cultures témoins). ( A1-A3) Effets de l’ajout de butyrate sur la croissance des cellules de type sauvage. Les cultures individuelles par lots ont été réalisées dans un milieu P2 chimiquement défini (réalisé dans des bouteilles de sérum) contenant du glucose (environ 42 g-L-1) et complété par 3,6 (A1), 7,2 (A2) et 10,8 g-L-1 (A3) d’acide butyrique. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) L’effet du butyrate ajouté sur la croissance des cellules irradiées (énergie 114 AMeV et doses de 20, 30 et 40 Gy). Les cultures individuelles par lots ont été réalisées dans un milieu P2 chimiquement défini (réalisé dans des bouteilles de sérum) contenant du glucose (environ 42 g-L-1) et complété par 3,6 (X1), 7,2 (X2) et 10,8 g-L-1 (X3) d’acide butyrique. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) Les effets du butyrate ajouté sur la croissance des cellules irradiées (énergie 114 AMeV et doses de 20, 30 et 40 Gy). Les cultures individuelles par lots ont été réalisées dans un milieu P2 chimiquement défini (réalisé dans des bouteilles de sérum) contenant du glucose (environ 42 g-L-1) et complété par 3,6 (X1), 7,2 (X2) et 10,8 g-L-1 (X3) d’acide butyrique.
Ces différences de pH régulent le commutateur temporel associé à la formation de solvant pour chaque souche irradiée. Cela suggère que les souches de type sauvage et irradiées ont présenté un modèle métabolique biphasique fortement influencé par le pH du milieu. En règle générale, les cellules ont d’abord consommé du glucose pour soutenir leur croissance, puis ont produit et excrété des acides organiques (butyrate et acétate) en tant que métabolites primaires (acidogénèse), ce qui a entraîné une diminution du pH du milieu lorsqu’ils se sont accumulés à certains niveaux. Cette augmentation de l’acidité du bouillon a déplacé la formation d’acides vers la production de solvants lorsque la culture a atteint la phase stationnaire de la croissance cellulaire (solvantogenèse). À pH élevé, les acides organiques sont principalement formés, tandis qu’à pH faible, la production de solvants est stimulée. Comme prévu, la nature du changement métabolique et le modèle cinétique de la formation de solvants dépendaient de la souche, étant donné que les souches irradiées présentaient leurs propres caractéristiques génétiques et métaboliques intrinsèques. On a déjà signalé que l’acide butyrique inhibe la croissance cellulaire. Les résultats ont montré que dans les souches de type sauvage, il y avait une inhibition graduelle de la croissance cellulaire, aucune croissance réaliste n’étant observée à des concentrations d’acide butyrique supérieures à 3,6 g-L-1. Cependant, dans les souches irradiées, il n’y a pas eu d’inhibition progressive de la croissance cellulaire, et aucune croissance réaliste n’a été observée pour des concentrations d’acide butyrique supérieures à 10,8 g-L-1.
Pour examiner plus en détail l’effet du butyrate ajouté, les profils de croissance cellulaire (basés sur les mesures de DO) pour les souches de type sauvage et les souches irradiées ont été comparés (Figure 2A1-G3) pendant les 54 premières heures de fermentation. Il est intéressant de noter que la tolérance à l’acide butyrique des souches a été considérablement améliorée lorsque l’énergie et la dose d’irradiation aux ions 12C6+ ont été augmentées. Les voies métaboliques du glucose chez C. tyrobutyricum ATCC 25755 sont présentées dans la figure 3. L’acétyl-CoA, l’acétoacétyl-CoA et le butyryl-CoA sont trois intermédiaires clés, et présentent un intérêt particulier pour la fermentation en raison du potentiel de formation de différents produits au cours de l’acidogenèse ou de la solvantogenèse. Ces intermédiaires sont des points de branchement importants qui orientent le flux métabolique vers la formation d’acide ou de solvant. En tant que dernier intermédiaire clé, le butyryl-CoA initie la formation de l’acide butyrique/butyrate. Le butyrate est produit par les activités séquentielles de la PTB et de la BK . Les deux enzymes sont les plus actives pendant l’acidogenèse et leurs activités spécifiques diminuent pendant la solvantogenèse, de deux fois pour la PTB et de six fois pour la BK . Habituellement, une forte activité pH-dépendante avec un optimum in vitro à des niveaux de pH acidogènes de 5,5 (optimal autour de pH 4,7) et un pH in vivo (endogène) supérieur à 5,5 sont nécessaires pour induire la solvantogenèse. Pourtant, une analyse comparative de ces tracés a clairement révélé un groupe principal composé des souches irradiées à 68 AMeV et 40 Gy et des souches irradiées à 114 AMeV et des doses de 30 et 40 Gy. Les deux groupes ont montré une tolérance globale très similaire à des concentrations croissantes de butyrate par rapport aux bactéries de type sauvage.
Voies métaboliques du glucose chez Clostridium tyrobutyricum . Les enzymes sont indiquées par des lettres comme suit : lactate déshydrogénase ; pyruvate-ferredoxine oxydoréductase ; NADH-ferredoxine oxydoréductase ; NADPH-ferredoxine oxydoréductase ; hydrogénase ; phosphate acétyltransférase (phosphotransacétylase) ; acétate kinase ; acétaldéhyde déshydrogénase ; éthanol déshydrogénase ; thiolase (acétyl-CoA acétyltransférase) ; acétoacétyl-CoA ; acétate/butyrate :CoA transférase ; acétoacétate décarboxylase ; 3-hydroxylbutyryl-CoA déshydrogénase ; crotonase ; butyryl-CoA déshydrogénase ; phosphate butyltransférase (phosphobutyrylase) ; butyrate kinase.
Effet de l’irradiation par les ions 12C6+ sur la production d’acide butyrique
La production d’acide butyrique des souches irradiées a été grandement améliorée à la fois en termes de concentration du produit final et de rendement par rapport à la souche de type sauvage, comme le montre la Figure 4B,E. La culture de C. tyrobutyricum non irradiée (souche de type sauvage, témoin) inoculée dans un milieu pauvre en glucose a commencé à consommer du sucre presque immédiatement, et la production d’acide butyrique a débuté 12 à 18 heures plus tard (Figure 4A,B). La même culture témoin inoculée dans un milieu de croissance clostridienne (CGM) contenant 60 g-L-1 de glucose a nécessité plus de 96 heures pour s’acclimater malgré le fait que les fermentations des souches irradiées et de la souche de type sauvage aient été testées dans les mêmes conditions. La période prolongée de métabolisme et de productivité minimale est due au fait que l’irradiation (différents paramètres) a provoqué un retard dans la phase logarithmique de la croissance cellulaire (Figure 4C,F). La tolérance à l’acide butyrique des souches irradiées a été grandement améliorée, leur permettant de produire plus d’acide butyrique, ce qui a entraîné une utilisation complète du glucose et la production de plus de 32 g-L-1 d’acide butyrique et des niveaux similaires de biomasse cellulaire. En outre, le rapport acide butyrique/contrôle est passé de 1,0 pour la souche de type sauvage à 1.52 pour les souches irradiées à 114 AMeV et 40 Gy, 1,37 pour les souches irradiées à 114 AMeV et 30 Gy, 1,41 pour les souches irradiées à 68 AMeV et 40 Gy, et 1,31 pour les souches irradiées à 68 AMeV et 30 Gy. Cette tendance indique que les flux de carbone et d’énergie ont été redistribués dans les voies métaboliques des souches irradiées, ce qui a également entraîné des changements significatifs dans la production de divers produits de fermentation. Il convient de noter que la production d’acide acétique (données non présentées) s’est stabilisée beaucoup plus tôt que celle de butyrate/butyrique au cours de la fermentation. Les fermentations se sont arrêtées lorsque le glucose n’était plus consommé par les cellules en raison d’une accumulation d’acides organiques et de déchets dans le bouillon, ce qui a entraîné une inhibition de la croissance cellulaire et d’autres activités. Cependant, les souches irradiées étaient plus tolérantes à l’acide butyrique, comme l’indique la concentration finale de butyrate beaucoup plus élevée atteinte dans les fermentations avec ces souches irradiées par rapport au type sauvage. Cela n’est pas tout à fait surprenant ; comme le montre la figure 3, la tolérance accrue à l’acide butyrique des souches irradiées peut également être attribuée à la réduction du flux par la voie PTA/AK du butyrate. Comme les souches irradiées ne dépendaient plus de la voie PTA/AK pour la production d’énergie et la survie, elles sont devenues moins sensibles à l’inhibition de l’acide butyrique .
Comparaison de la production d’acide et de biomasse en poids sec de C. tyrobutyricum de type sauvage et irradié cultivé sur du glucose (contenant 60 g-L-1) dans un milieu de croissance clostridien à 37°C à pH 5,5 et 6,0. (A-C) Impact de l’irradiation aux ions 12C6+ (énergie 68 AMeV et doses de 20, 30 et 40 Gy) sur la concentration en glucose, la production d’acide butyrique et le poids sec de la biomasse. (D-F) Impact de l’irradiation aux ions 12C6+ (énergie 114 AMeV et doses de 20, 30 et 40 Gy) sur la concentration en glucose, la production d’acide butyrique et le poids sec de la biomasse. (G) SDS-PAGE des protéines cellulaires de C. tyrobutyricum. Couloir WT : type sauvage ; couloir 1 : cellules irradiées à 68 AMeV et à une dose de 30 Gy ; couloir 2 : cellules irradiées à 68 AMeV et à une dose de 40 Gy ; couloir 3 : cellules irradiées à 114 AMeV et à une dose de 30 Gy ; couloir 4 : type sauvage et cellules irradiées à 114 AMeV et à une dose de 40 Gy ; couloir MW : marqueurs de poids moléculaire des protéines.
L’induction des gènes ack et pta, qui codent pour des enzymes associées à la voie de formation de l’acétate, améliore significativement la production d’acide butyrique . Pour mieux comprendre la cinétique de fermentation du métabolisme du glucose après l’exposition de C. tyrobutyricum à l’irradiation par ions 12C6+ et les dommages résultants sur les gènes ack et pta, l’expression protéique des souches de type sauvage et irradiées a été étudiée et comparée. La figure 4G montre les résultats de la SDS-PAGE. L’analyse a confirmé l’expression de la protéine (poids moléculaire, environ 85 kDa) dans quatre souches irradiées, avec le niveau d’expression protéique le plus élevé dans la voie 4. La quantité d’une protéine d’environ 106 kDa était beaucoup plus élevée pour la souche irradiée à 114 AMeV et 40 Gy que pour la souche de type sauvage. L’AK et la PTA de plusieurs micro-organismes ont été caractérisées, mais les résultats ont montré de grandes variations dans leur poids moléculaire . Des essais d’activité enzymatique ont donc été réalisés pour étudier plus avant les rôles de l’AK, de la PTA et de la PTB dans les voies de formation des acides (figure 3). La sélectivité métabolique de C. tyrobutyricum est influencée par le stade de croissance, les cultures à croissance exponentielle produisant à la fois de l’acide butyrique et de l’acide acétique, tandis que les cultures à croissance stationnaire plus lente ont tendance à produire de l’acide butyrique. Ainsi, pendant la croissance en phase logarithmique de chaque lot, des échantillons de culture ont été prélevés et analysés pour les activités de PTA, PTB et AK dans les souches irradiées et de type sauvage. Les activités enzymatiques spécifiques de la PTA, de la PTB et de l’AK dans les souches irradiées (différents paramètres physiques) ont été analysées et leurs activités relatives ont été comparées à celles de la souche de type sauvage. L’activité AK était réduite d’environ 47 % pour les souches irradiées à 114 AMeV et 40 Gy, de 31 % pour les souches irradiées à 114 AMeV et 30 Gy et de 26 % pour les souches irradiées à 68 AMeV et 40 Gy. Par rapport aux souches de type sauvage, les souches irradiées à 114 AMeV et 40 Gy avaient une activité AK plus faible (47 %) mais une activité PTA plus élevée (129 %), bien que des activités PTB similaires. Comme les souches irradiées à 114 AMeV avaient une activité AK beaucoup plus faible, la voie PTA-AK aurait été altérée et, par conséquent, elles ont produit plus de butyrate (60 g-L-1) à partir du glucose que les souches de type sauvage. Comme mentionné précédemment, ces améliorations et perfectionnements peuvent être attribués à une tolérance accrue à l’inhibition du butyrate et, dans une certaine mesure, à la réduction du flux de carbone par la voie PTA-AK, comme en témoigne l’augmentation du rapport butyrate/acétate dans les souches irradiées.
Effet de l’irradiation au 12C6+ sur le rendement en acide et la croissance de C. tyrobutyricum
Une expérience a été menée en mode fermentation en utilisant le glucose comme source de carbone primaire afin de déterminer la capacité de production de butyrate de C. tyrobutyricum ATCC 25755 après irradiation. Comme on peut le voir sur la Figure 5A,B, le rendement en acide butyrique à partir du glucose a augmenté de manière significative, passant de 0,43 g-g-1 pour les souches de type sauvage à 0,56 g-g-1 pour la souche irradiée à 68 AMeV et à une dose de 30 Gy, 0.59 g-g-1 pour la souche irradiée à 68 AMeV et une dose de 40 Gy, 0,63 g-g-1 pour la souche irradiée à 114 AMeV et une dose de 30 Gy, et 0,66 g-g-1 pour la souche irradiée à 114 AMeV et une dose de 40 Gy. Il est à noter que le rendement en butyrate pour la souche irradiée à 114 AMeV et une dose de 40 Gy aurait été plus élevé (>0,66 g-g-1) si la consommation de glucose pendant la phase de latence était négligée. L’acide acétique produit par la souche irradiée à 68 AMeV et à des doses de 30 et 40 Gy était similaire à celui du type sauvage. Cependant, l’acide acétique produit par la souche irradiée à 114 AMeV et à des doses de 30 et 40 Gy a diminué par rapport à celui du type sauvage. Comme le montre la figure 5B, le rendement en acide acétique à partir du glucose a également diminué de manière significative, passant d’environ 0,11 g-g-1 pour la souche de type sauvage à environ 0,08 g-g-1 pour la souche irradiée à 114 AMeV et 30 Gy, et à environ 0,07 g-g-1 pour la souche irradiée à 114 AMeV et 40 Gy. Néanmoins, le rapport butyrate/acétate (g/g) est passé de 3,99 pour la souche de type sauvage à 5,82 pour les souches irradiées, ce qui indique clairement que les voies métaboliques des souches irradiées ont été modifiées pour favoriser la production d’acide butyrique plutôt que d’acide acétique. Comme le montre la figure 3, étant donné que les activités AK et PTA étaient considérablement réduites dans les souches irradiées, davantage de pyruvate a dû être catabolisé par la voie de production de butyrate, ce qui a conduit à des rendements plus élevés en butyrate à partir du glucose. En outre, l’acide butyrique pourrait également avoir favorisé un passage plus précoce à la voie de production d’acide, ce qui pourrait se traduire par un taux de croissance plus lent. Pour la même raison, les échantillons irradiés ont souffert d’un taux de croissance plus lent car moins d’ATP a été produit par la voie productrice d’acétate (PTA-AK), qui peut normalement générer plus d’ATP par mole de glucose métabolisé que la voie productrice de butyrate (PTB-BK) .
Comparaison de la production d’acide pour les cellules C. tyrobutyricum de type sauvage et irradiées. (A) La production d’acide butyrique et d’acide acétique a été estimée à partir des pentes des tracés linéaires pour les cellules de type sauvage et les cellules irradiées à 68 AMeV et à des doses de 30 et 40 Gy. (B) La production d’acide butyrique et d’acide acétique a été estimée à partir des pentes des courbes linéaires pour les cellules de type sauvage et les cellules irradiées à 114 AMeV et à des doses de 30 et 40 Gy. (C) Linéarisation (intégration) des profils de croissance cinétique du poids sec de la biomasse en fonction du temps en utilisant une transformation en logarithme naturel. Les taux de croissance spécifiques maximaux pour les cellules de type sauvage et irradiées ont été calculés selon l’exemple donné pour les cellules irradiées à 114 AMeV et à une dose de 40 Gy cultivées dans un milieu de croissance Clostridium contenant 60 g-L-1 de glucose. BDW, biomass dry weight.
Un tracé de μ max a ensuite été déterminé à des concentrations élevées de glucose initial (40, 60, 80 et 120 g-L-1) en ajustant les données de fermentation aux prédictions de la simulation du modèle. La linéarisation (intégration) des profils de croissance cinétique du poids sec de la biomasse (BDW) en fonction du temps ont été réalisés en utilisant la transformation du logarithme naturel :
Où x(t) = concentration de BDW à chaque instant x 0 ; t = concentration initiale de BDW ; μ max = taux de croissance spécifique maximal (h-1) ; et le taux de croissance spécifique est μ = (1/x(t)). – (dx/dt). À des fins de simplification, il a été supposé que toutes les bactéries suivaient la loi exponentielle de la croissance cellulaire dans une culture par lots selon un modèle cinétique de premier ordre . Le taux de croissance spécifique des cellules, ou l’augmentation de la masse cellulaire au fil du temps, représente un changement de sélectivité à différents taux de croissance, ce qui a un impact significatif sur le processus de fermentation . Une croissance cellulaire rapide a une demande énergétique plus élevée et produit préférentiellement de l’acide acétique. À faible taux de croissance, la production d’acide butyrique est favorisée par rapport à l’acide acétique. Pour une fermentation continue, la production de butyrate/acide butyrique est plus élevée lorsque μ est plus faible. Lorsque μ tend vers zéro, une oscillation de la productivité se produit . Ces équations permettent de comparer le taux de croissance des systèmes discontinus et continus au sein des souches de type sauvage et des souches radiées.
Le modèle n’est pas indépendant du milieu : le milieu utilisé comme décrit ci-dessus affecte à la fois le taux de croissance cellulaire et les quantités d’acide butyrate/butyrique produites, et des profils de consommation de glucose différents produiraient des résultats différents. Pour mieux quantifier la concentration optimale de glucose pour la croissance cellulaire, les taux de croissance spécifiques maximaux ont été déterminés pour les souches de type sauvage et irradiées à partir de données cinétiques prises dans la phase de croissance exponentielle et tracées en fonction de la concentration de glucose ajoutée. Comme on peut le voir sur la figure 5C, les taux de croissance spécifiques maximaux pour les souches irradiées à 114 AMeV et à une dose de 40 Gy ont été calculés selon l’exemple où la souche était cultivée dans un milieu CGM contenant 60 g-L-1 de glucose. On a choisi la meilleure plage linéaire de points de données qui correspond à la phase de croissance exponentielle de la souche. Dans certains cas, lorsque l’exigence minimale de trois points de données expérimentales n’était pas satisfaite, on a utilisé une autre expression qui ne tenait compte que de deux points extrêmes (au début et à la fin de la phase exponentielle). La pente de la ligne droite (m = μmax) donne le taux de croissance spécifique maximal (0,213 h-1). Le modèle de régression linéaire unaire (y = 0,2129x – 2,6457) avait un coefficient de détermination ajusté de R2 = 0,9765, indiquant que tous les points de données étaient inclus sur la ligne de meilleur ajustement et qu’aucun point de données ne variait de cette ligne. De plus, chaque taux de croissance spécifique a été estimé à partir de la pente du tracé semi-logarithmique correspondant de la BDW en fonction du temps. Les barres d’erreur sont exprimées en termes d’écart-type (ET) obtenu à partir des calculs de chaque réplique de fermentation indépendante pour les souches irradiées et le type sauvage (les données originales ne sont pas présentées). Les résultats montrent que ces souches irradiées ont un taux de croissance spécifique significativement plus faible (μ = 0,38 ±0,03 à 0,21 ±0,02 h-1) par rapport au type sauvage (μ = 0,38 à 0,42 h-1). L’utilisation d’une irradiation par ions 12C6+ à 68 AMeV, 20 à 40 Gy et 106 à 108 ions-impulsion-1 a entraîné des phases de retard particulièrement longues de 10, 12 et 16 h, respectivement. Par comparaison, l’utilisation d’une irradiation par ions 12C6+ à 114 AMeV, 20 à 40 Gy et 106 à 108 ions par impulsion-1 a entraîné des phases de latence de 12, 18 et 24 heures, respectivement. Ces phases de latence plus longues peuvent être partiellement attribuées aux différents paramètres d’irradiation et à la faible densité d’inoculation utilisée dans la fermentation. Le taux de croissance spécifique plus faible pour les cellules irradiées peut être le résultat de la charge métabolique imposée aux cellules en raison de la plus faible quantité d’énergie générée par le métabolisme du glucose en raison des dommages induits à des énergies et des doses plus élevées. Par rapport aux souches de type sauvage, les souches irradiées à 20 et 30 Gy à 68 AMeV présentaient des profils de croissance et de consommation de glucose similaires, avec un taux de croissance spécifique presque identique de μ = 0,42 ±0.03 h-1, tandis que les souches irradiées à 30 et 40 Gy à 114 AMeV présentaient une phase de latence significativement plus longue, une consommation de glucose plus lente et un taux de croissance spécifique beaucoup plus faible de μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) et μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Comme indiqué précédemment, l’acétate est synthétisé via les réactions PTA et AK, cette dernière réaction fournissant de l’ATP (Figure 3). Pour la biosynthèse du butyrate, deux molécules d’acétyl-CoA sont condensées en acétoacétyl-CoA, suivi d’une réduction en butyryl-CoA, qui est ensuite converti en butyrate via les réactions PTB et BK avec génération d’ATP. Le taux de croissance spécifique plus faible pour les souches irradiées (énergie 114 AMeV et doses de 30 et 40 Gy) peut être attribué à la charge métabolique sur les cellules causée par une génération d’énergie (ATP) moindre pendant le métabolisme du glucose en raison des dommages causés par l’irradiation à ack et pta. Le BDW du glucose pour les souches irradiées varie également par rapport aux souches de type sauvage. Le tracé du BDW en fonction du temps et du taux de croissance spécifique des souches irradiées a indiqué que les flux de carbone et d’énergie ont été redistribués tout au long des voies métaboliques de ces souches, ce qui a également entraîné des changements significatifs dans la production d’acide des produits de fermentation.