Le coronavirus maladie 2019 (COVID-19) est une maladie infectieuse qui a provoqué une pandémie mondiale avec plus de 36 millions de personnes infectées dans environ 200 pays ou territoires, avec plus d’un million de décès à ce jour (Organisation mondiale de la santé (OMS), 2020). L’agent responsable du COVID-19, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), est supposé être originaire des chauves-souris, puisque le coronavirus RaTG13 transmis par les chauves-souris est le parent génétique le plus proche à ce jour (Andersen et al., 2020 ; Zhou et al., 2020). Plusieurs espèces ont été étudiées pour déterminer leur rôle potentiel en tant qu’hôtes intermédiaires (Shi et al., 2020). En outre, les modèles animaux permettant de récapituler une maladie de type COVID-19 sont considérés comme une ligne de recherche majeure et nécessaire pour le développement de médicaments thérapeutiques et de composés prophylactiques.
En plus de plusieurs études de modélisation proposant des espèces animales potentielles sensibles au SRAS-CoV-2 (Damas et al., 2020 ; Qiu et al., 2020 ; Veljkovic et al., 2020), de multiples infections expérimentales ont déjà montré un large éventail d’animaux sensibles. Plus précisément, la chauve-souris frugivore égyptienne, le furet, le hamster doré syrien, le chat, les souris exprimant l’enzyme 2 de conversion de l’angiotensine humanisée (ACE2), les souris BALB/c (utilisant un SARS-CoV-2 muté par plusieurs passages en culture cellulaire) et certaines espèces de primates non humains sont permissives à l’infection virale, développant une maladie respiratoire subclinique ou légère à modérée (Bao et al, 2020 ; Halfmann et al., 2020 ; Kim et al., 2020 ; Rockx et al., 2020 ; Shi et al., 2020 ; Yu et al., 2020). D’un point de vue expérimental, la sensibilité des chiens au SRAS-CoV-2 est limitée, puisque les animaux inoculés peuvent partiellement se séroconvertir (Shi et al., 2020). En revanche, l’inoculation intranasale de poulet, de canard et de porc n’a donné lieu à aucune preuve d’infection (Schlottau et al., 2020 ; Shi et al., 2020).
Le porc est couramment utilisé dans la recherche en raison des similitudes existant avec l’homme en termes d’anatomie, de génétique, de physiologie et, également, d’immunologie. En effet, les expériences sur les porcs sont susceptibles d’être plus prédictives des traitements thérapeutiques et préventifs chez l’homme que les expériences sur les rongeurs (Meurens et al., 2012). Cependant, étant donné que les porcs ne sont pas sensibles à l’infection par le SRAS-CoV-2 lorsqu’ils sont inoculés par voie intranasale (Schlottau et al., 2020 ; Shi et al., 2020), la possibilité de développer un modèle d’infection porcine par ce virus en utilisant d’autres voies d’inoculation potentielles mérite d’être étudiée. La principale raison de tester le porc est que le récepteur ACE2 de cette espèce est fonctionnel, soit en transfectant l’ACE2 du porc dans des cellules HeLa (qui n’expriment pas de manière constitutive l’ACE2 humain) (Zhou et al., 2020), soit que des pseudoparticules contenant la protéine S du SRAS-CoV-2 sont capables d’infecter des cellules rénales de porc (Letko et al., 2020). En outre, la protéine ACE2 est exprimée dans tous les principaux tissus des porcs, comme l’indique l’immunohistochimie (Xiao et al., 2020). En conséquence, pour mettre en place un modèle putatif de porc COVID-19, nous avons étudié l’effet de différentes voies naturelles et non naturelles d’inoculation du SRAS-CoV-2 chez les porcs domestiques (Sus scrofa domesticus).
À cette fin, quatre groupes de cinq porcelets conventionnels âgés de 5 à 6 semaines (Landrace × Large White) ont été sélectionnés et inoculés par différentes voies : intranasale (IN, 1,5 ml/nostril ; volume total de 3 ml), intratrachéale (IT, 3 ml) comme décrit précédemment (Garcia-Morante et al, 2016), intramusculaire (IM, 1 ml dans chaque côté des muscles du cou ; volume total de 2 ml) ou intraveineux (IV, 2 ml), avec une dose finale de 105,8 doses infectieuses en culture tissulaire (DICT50) de l’isolat SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_510689) par animal. Les groupes IT et IV ont été anesthésiés avec 10 mg/kg de kétamine et 0,8 mg/kg de xylazine avant l’inoculation. Un SARS-CoV-2 de passage-2 a été propagé et titré dans des cellules Vero E6 (ATCC CRL-1586), selon le même protocole que pour les autres coronavirus (Rodon et al., 2019). Deux porcs supplémentaires ont été utilisés comme témoins négatifs.
Tous les animaux étaient séropositifs contre le coronavirus respiratoire porcin, comme déterminé par un ELISA commercial (INgezim Corona Diferencial 2,0 ). Compte tenu du fait qu’aucune réactivité croisée des anticorps entre les alpha et bêta-coronavirus n’a été décrite (Okba et al., 2020), les animaux ont été maintenus dans l’étude. Une réactivité initiale contre le PRCV était attendue puisque ce virus est omniprésent dans le cheptel porcin européen (Saif et al., 2012 ; Vidal et al., 2019).
Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de bien-être animal de l’Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) et par la Commission éthique de l’expérimentation animale du gouvernement autonome de Catalogne et réalisées par du personnel certifié. Les expériences avec le SARS-CoV-2 ont été réalisées dans les installations de niveau de biosécurité 3 (BSL-3) de l’unité de bioconfinement de l’IRTA-CReSA (Barcelone, Espagne).
Les 2 et 22 jours après l’inoculation (dpi), deux et trois animaux/groupe (IT, IM et IV), respectivement, ont été euthanasiés. Comme il a déjà été démontré que l’inoculation par voie IN n’était pas efficace pour provoquer une infection par le SRAS-CoV-2 (Shi et al., 2020), les porcs inoculés par cette voie ont été euthanasiés aux jours 1 et 2 pi pour évaluer les preuves d’une éventuelle infection précoce transitoire dans les tissus. Les animaux témoins négatifs ont été euthanasiés avant le début de l’expérience. Les échantillons ont été collectés et traités comme décrit précédemment (Vergara-Alert et al., 2017). Brièvement, des nécropsies complètes ont été réalisées chez tous les animaux. Plusieurs tissus (turbinats frontaux, médians et caudaux ; trachée proximale, médiane et distale ; grandes et petites bronches, zones pulmonaires crâniennes, médiodorsales et caudales gauches ; rein ; foie ; cœur ; et rate) ont été prélevés, fixés par immersion dans du formol tamponné neutre à 10 %, inclus dans de la paraffine et sectionnés à 3 µm pour préparer des lames. Les lames d’histologie ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) pour évaluer les éventuelles lésions microscopiques. En outre, les mêmes tissus ainsi que l’iléon, le ganglion lymphatique cervical (LN), le LN médiastinal, le LN mésentérique, le bulbe olfactif, l’amygdale, le thymus, la glande salivaire parotide, la surrénale, le pancréas, le tronc cérébral, les paupières et la moelle osseuse ont été prélevés dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) dans des tubes avec des billes pour effectuer la détection du gène SARS-CoV-2 upE par RT-qPCR (Corman et al., 2020). Des écouvillons nasaux et rectaux ont également été prélevés (quotidiennement au cours de la première semaine et à 14 et 22 dpi) afin de les analyser pour détecter la présence d’ARN viral au moyen de la RT-qPCR susmentionnée. Des échantillons de sérum prélevés aux jours 0, 14 et 22 pi ont été analysés pour détecter la présence d’anticorps contre les protéines S1 + S2 des pics du SRAS-CoV-2 et de la nucléocapside (N) par des tests ELISA internes (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). De plus, un test de neutralisation du virus a été réalisé suivant un protocole précédent avec une modification mineure (Rodon et al., 2020), les dilutions sérielles de sérums et de SARS-CoV-2 ont été incubées pendant 1 h à 37°C avant la réalisation du test sur plaque.
Tous les animaux ont été surveillés quotidiennement mais aucun d’entre eux n’a présenté de signes cliniques après l’inoculation du SARS-CoV-2. De plus, aucune lésion macroscopique ou microscopique attribuable à l’infection par le SRAS-CoV-2 n’a été trouvée chez les animaux étudiés de tous les groupes d’inoculation ainsi que chez les animaux témoins (données non présentées).
Aucune des porcs n’a présenté d’excrétion nasale ou rectale d’ARN viral. La trachée proximale d’un animal inoculé par IN était positive à 1 dpi pour l’ARN viral (Cq = 24,36). Les autres tissus de cet animal et du reste des porcs se sont révélés négatifs pour la RT-qPCR (limite de détection de la qPCR de 38,6 cycles).
À 14 et 22 dpi, de faibles niveaux d’anticorps dirigés contre la protéine Spike ont pu être détectés chez tous les animaux des groupes IM et IV (Figure 1a). En outre, ces porcs présentaient également des titres d’anticorps neutralisants à 22 dpi (allant de 74 à 317 titres de dilution réciproque SNT50) (Figure 1b). De plus, de faibles titres d’anticorps ciblant la protéine N ont été trouvés chez un des trois animaux inoculés par voie IM et chez tous les animaux inoculés par voie IV à la fin de l’expérience (données non présentées). Il est important de noter qu’un seul animal du groupe IT n’a pas présenté d’anticorps contre la protéine S mais avait des anticorps contre la protéine N ainsi que des titres neutralisants (titre de dilution réciproque SNT50 de 29) au jour 0 pi, ce qui pourrait suggérer une réaction croisée potentielle avec un autre coronavirus infectant les porcs. Il est à noter que ces anticorps dirigés contre la protéine N ont diminué à la fin de l’expérience, ce qui suggère qu’ils étaient d’origine maternelle. De plus, cet animal ne présentait pas d’anticorps séroneutralisants à la 22 dpi (figure 1b).
Les données actuelles indiquent que le SRAS-CoV-2 n’a pu infecter les porcs par aucune des voies testées, à savoir IN, IT, IM et IV. Par conséquent, nos efforts confirment les expériences antérieures indiquant l’absence de sensibilité de l’infection par le porc (Schlottau et al., 2020 ; Shi et al., 2020), bien qu’il puisse être utilisé pour évaluer l’immunogénicité des candidats vaccins à venir.
Important, l’étude actuelle va au-delà des autres études sur le SRAS-CoV-2 et les porcs puisque nous avons testé un plus grand nombre de voies d’inoculation. Cependant, aucune d’entre elles n’a donné lieu à une infection productive chez les porcelets. Un résultat significatif de cette étude est la mise en évidence d’une séroconversion contre la glycoprotéine Spike aux jours 14 et 22 pi et la présence d’anticorps neutralisants au jour 22 pi chez les porcs inoculés par voie parentérale (IM et IV). Compte tenu de la courte durée de l’expérience (22 jours), cette séroconversion souligne l’intérêt potentiel du porc pour être utilisé dans les études d’immunogénicité du SRAS-CoV-2. En fait, l’intérêt du porc en tant que modèle animal approprié pour l’immunologie, ainsi que pour la physiologie, la pharmacologie et la chirurgie, applicables à la médecine humaine est largement reconnu (Rothkötter, 2009).
En conclusion, la présente étude confirme que le porcelet n’est pas un modèle animal approprié pour le COVID-19, mais son utilité potentielle comme modèle d’immunogénicité dans les études précliniques de développement de vaccins mérite d’être approfondie.