Antoine Hennepin est né à Ath dans les Pays-Bas espagnols (actuel Hainaut, Belgique). En 1659, alors qu’il réside dans la ville de Béthune, celle-ci est prise par l’armée de Louis XIV de France. Henri Joulet, qui accompagnait Hennepin et a écrit son propre journal de voyage, a qualifié Hennepin de Flamand (natif des Flandres), bien que l’Ath était et est toujours une région de langue romane située dans l’actuelle Wallonie. L’utilisation du terme « Flamand » par Joulet dénote ici un manque de compréhension ou de généralisation de ce démonyme, qui était courant à l’époque.
Hennepin rejoint les Franciscains, et prêche aux Halles (Belgique) et en Artois. Il est ensuite mis en charge d’un hôpital à Maestricht. Il est aussi brièvement aumônier de l’armée.
À la demande de Louis XIV, les Récollets envoient quatre missionnaires en Nouvelle-France en mai 1675, dont Hennepin, accompagné de René Robert Cavelier, sieur de la Salle. En 1676, Hennepin se rend à la mission indienne de Fort Frontenac, et de là, chez les Mohawks.
En 1678, Hennepin reçoit l’ordre de son supérieur provincial d’accompagner La Salle dans une expédition visant à explorer la partie occidentale de la Nouvelle-France. Hennepin partit en 1679 avec La Salle de Québec pour construire la barque de 45 tonnes Le Griffon, naviguer sur les Grands Lacs et explorer l’Ouest inconnu.
Hennepin était avec La Salle lors de la construction du fort Crevecoeur (près de l’actuelle Peoria, Illinois) en janvier 1680. En février, La Salle envoie Hennepin et deux autres personnes en détachement précurseur pour rechercher le fleuve Mississippi. Le groupe suit la rivière Illinois jusqu’à sa jonction avec le Mississippi. Peu après, Hennepin fut capturé par un groupe de guerriers sioux et emmené pendant un certain temps dans ce qui est aujourd’hui l’État du Minnesota.
En septembre 1680, grâce à Daniel Greysolon, Sieur Du Lhut, Hennepin et les autres reçurent des canoës et furent autorisés à partir, pour finalement retourner à Québec. Hennepin retourna en France et ne fut jamais autorisé par son ordre à revenir en Amérique du Nord. Les historiens locaux attribuent au frère franciscain Récollet le mérite d’avoir été le premier Européen à débarquer sur le site de l’actuelle Hannibal, dans le Missouri.
Deux grandes chutes d’eau ont été portées à l’attention du monde par Hennepin : Les chutes du Niagara, dont le débit est le plus volumineux de tous ceux d’Amérique du Nord, et les chutes de Saint-Antoine, dans l’actuelle Minneapolis, la seule chute d’eau naturelle sur le fleuve Mississippi. En 1683, il a publié un livre sur les chutes du Niagara intitulé A New Discovery. Le peintre régionaliste Thomas Hart Benton a créé une peinture murale, « Father Hennepin at Niagara Falls » pour la New York Power Authority à Lewiston, New York.