Nouvelles techniques d'isolement de micro-organismes avec accent sur l'impression laser | CDhistory

Nouvelles méthodes d’isolement

De nos jours, une grande variété de méthodes est utilisée pour exposer de nouveaux micro-organismes non cultivés auparavant. En particulier, de nouveaux milieux nutritifs contenant des substances spécifiques sont utilisés ; la culture est effectuée dans différentes conditions physiques et chimiques de l’environnement, telles que la composition atmosphérique, la température et le pH. En outre, les applications des milieux nutritifs dilués en combinaison avec de longues périodes d’incubation, ainsi que la culture conjointe de micro-organismes de différentes espèces, ont été étudiées. Ces dernières années, de nouvelles méthodes de culture basées sur le placement des micro-organismes dans l’environnement naturel sans l’utilisation de milieux nutritifs ont été développées. Ces méthodes utilisent des chambres de diffusion et des revêtements en polymère dans lesquels sont placées les cellules microbiennes. Dans ce cas, les micro-organismes reçoivent tous les nutriments nécessaires de l’environnement naturel, en restant isolés de celui-ci. L’attribution d’un nouveau producteur d’antibiotique (teixobactine) à l’aide de ces méthodes est considérée comme une réalisation importante. Une autre approche comprend la culture et le criblage simultanés de dizaines et de centaines de milliers de microcolonies bactériennes sur des puces d’isolement poreuses en polymère ou en céramique. Pour la culture de micro-organismes « non cultivables », des méthodes permettant d’isoler des cellules uniques à partir d’environnements naturels peuvent également être utilisées. Parmi ces méthodes, la plus populaire est basée sur la dilution de la suspension de micro-organismes, la cytométrie de flux et le tri cellulaire, la microdissection laser, la compartimentation et l’application de micromanipulateurs. En plus de la culture d’espèces de microorganismes non cultivées auparavant, l’isolement de cellules microbiennes individuelles est nécessaire pour l’étude de la physiologie cellulaire, des interactions entre les cellules, ainsi que pour la recherche de nouveaux métabolites, tels que les antibiotiques et les enzymes.

Les progrès scientifiques et technologiques modernes offrent de nombreuses opportunités en termes de développement de nouvelles méthodes de culture, d’isolement, de manipulation et d’étude des cellules bactériennes individuelles et de leurs consortiums. De nouvelles approches peuvent accélérer considérablement le processus de travail avec les micro-organismes et permettre de réaliser leurs études plus complètes et globales. Il est nécessaire de noter que, jusqu’à présent, très peu de méthodes ont été proposées pour le positionnement de réseaux de bactéries avec une précision de l’ordre du micromètre. Akselrod et al. ont formé des réseaux tridimensionnels (3D) de cellules vivantes dans un hydrogel sans perte de leur viabilité en utilisant des réseaux de pièges optiques holographiques multiplexés (pinces) avec une précision sans précédent (<400 nm). Pour former les pièges optiques, deux lasers ont été utilisés : Laser Ar+ (20 W, longueur d’onde 514 nm) et laser Ti : Sapphire à onde continue, accordable dans la gamme de λ = 850-900 nm, ainsi qu’une combinaison de deux éléments de diffraction, associés à différentes lentilles dans un microscope optique inversé. Des réseaux de fibroblastes 3T3 entourés d’un anneau de bactéries ont été formés. La capacité de manipuler simultanément des centaines de bactéries Pseudomonas aeruginosa dans des réseaux bidimensionnels (2D) et 3D a également été démontrée. La méthode de piégeage optique holographique est très précise mais techniquement difficile à réaliser.

Dans l’étude de Rowan et al, la méthode de fonctionnalisation hétérogène des surfaces est proposée, qui est un processus lithographique en quatre étapes basé sur l’impression par microcontact de monocouches organiques, l’implantation de polymère hyperbranché et sa fonctionnalisation ultérieure. Le résultat est l’obtention de structures sur lesquelles est effectuée l’inoculation dirigée de cellules bactériennes. Les études sur la survie cellulaire ont montré que les cellules restent viables sur les surfaces structurées obtenues. De grands isolats de bactéries contenant 18 ± 5 bactéries et de petits isolats contenant 2 ± 1 bactéries ont été obtenus. D’après cet article, la méthode démontrée peut être utilisée pour le criblage à haut débit et la biodétection. Cependant, il est difficile de combiner la fonctionnalisation hétérogène des surfaces à l’aide de cette méthode avec la recherche biologique de routine et les conditions de culture des microorganismes (température, pH, nutriments, etc.). Il est nécessaire de noter que la tâche de trouver des moyens simples pour fournir une haute résolution des réseaux de bactéries vivantes avec la possibilité de diverses études biologiques a été résolue dans certaines publications. Les approches proposées dans ces travaux sont, en fait, les signes avant-coureurs de l’impression 3D.

Dans une étude de Weibel et al, la technique d’estampage de bactéries vivantes sur des plaques d’agarose a été proposée. Des réseaux de bactéries ont été imprimés (la taille d’un seul point avec des bactéries >200 µm) dans la zone allant jusqu’à 50 cm2. Des tampons en polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été produits à l’aide de la technique photolithographique. La taille minimale atteinte de la protubérance de l’empreinte était de 190 µm pour une hauteur de 140 µm, ce qui est toutefois loin de la taille requise pour séparer les bactéries. Cette méthode est rapide, reproductible et pratique et peut être utilisée pour contrôler le motif, l’espacement et l’orientation entre les colonies de différentes bactéries. Dans l’étude de Xu et al., des réseaux de bactéries vivantes avec une résolution cellulaire ont été imprimés sur un substrat d’agarose à l’aide de tampons élastomères (PDMS) avec un rapport d’aspect élevé, obtenu par la méthode de lithographie in situ inversée (RISL). La figure 1 montre les avantages de la méthode RISL par rapport à la photolithographie ultraviolette standard. La seule limite de la technologie RISL est le diamètre de la protubérance, qui peut difficilement être <1 µm en raison de la limite de diffraction optique.

La méthode d’impression par microcontact de matrices de bactéries fonctionne comme suit : La goutte d’Escherichia coli dans le milieu de culture LB est déposée sur un gel d’agarose (3 % en poids dans le LB) et, sur le substrat d’agarose, une monocouche de bactéries se forme (le liquide est absorbé par le gel d’agarose). Ensuite, le tampon en PDMS entre en contact avec une monocouche de bactéries recouvrant le gel d’agarose. Le tampon est retiré, et la partie de bactéries reste sur le tampon. Puis, au contact du tampon avec la couche de gel d’agarose (4 % en poids de LB, épaisseur 200 µm), les bactéries sont transférées sur la couche d’agarose. Ainsi, en quelques secondes, des réseaux de bactéries E. coli peuvent être imprimés directement sur le substrat d’agarose avec une résolution de l’ordre du micron, jusqu’à des bactéries uniques, sur une grande surface (cm2). Il a été démontré qu’après l’impression du motif, les bactéries continuent à croître et à se diviser, comme dans les conditions d’une culture de masse, c’est-à-dire que les bactéries conservent leur comportement physiologique normal après l’impression. Il a également été démontré que la concentration d’agarose est cruciale pour une bonne performance d’impression. Une concentration trop faible entraîne une déformation du motif imprimé, tandis qu’une concentration trop élevée ne convient pas à la culture de bactéries. Pour obtenir des réseaux de bactéries uniques, l’effet de la réduction de la concentration initiale de bactéries dans une goutte du milieu de culture LB a été étudié. Pour les concentrations initiales de 109 et 108 cellules/ml, le nombre moyen de bactéries par spot a été mesuré à 12,1 et 1,4, respectivement. Une distribution très étroite a été obtenue à la faible concentration de bactéries : 44,6% des spots ne contenaient qu’une seule cellule d’E. coli et 40,1% des spots contenaient 0 ou 2 cellules. Ces résultats ont démontré que l’impression par microcontact permet de produire des réseaux réguliers de bactéries uniques. De plus, il a été démontré que cette approche de la séparation des matrices bactériennes permet d’analyser les taux de croissance des lignes individuelles de bactéries. Cette méthodologie fournit un moyen simple pour toute distribution spatiale 2D désirée de bactéries et peut être utilisée à la fois pour le dépistage et les études de la variation phénotypique bactérienne, la dynamique des populations et l’évolution des écosystèmes.

Un domaine en développement rapide – la sociomicrobiologie – a identifié les mécanismes à l’aide desquels les bactéries participent à des relations de collaboration et de compétition en influençant les voisins proches par le contact physique et la modification de la composition chimique de leur microenvironnement commun. Pour explorer le comportement de petits agrégats microbiens, différentes technologies de microtraitement qui limitent les bactéries dans des dispositifs microfluidiques, des microrésonateurs et des gouttelettes de liquide à très faible volume ont été développées. La possibilité d’intégrer des systèmes analytiques à la microfluidique a rendu ces plates-formes d’isolement attrayantes pour le dépistage à haute performance de la résistance aux antibiotiques et l’analyse de l’activité enzymatique. Par exemple, Eun et al. décrivent une analyse et un isolement à haute performance de cellules bactériennes encapsulées dans des microparticules d’agarose à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Des systèmes microfluidiques à flux focalisé ont été utilisés pour créer des microparticules monodispersées d’un diamètre de ≈30 µm. Les tailles de ces particules les ont rendues compatibles avec la cytométrie en flux et le FACS, et la sensibilité de ces méthodes a permis de réduire le temps d’incubation pour la réplication des cellules avant la réalisation des analyses. Le faible volume des microparticules (≈1-50 picolitres) a minimisé le nombre de réactifs nécessaires aux études bactériennes. Cette plateforme a permis de répartir et d’isoler efficacement les bactéries, ainsi que d’utiliser la combinaison de méthodes pour l’identification rapide de cibles pour les petites molécules biologiquement actives. Comme démonstration expérimentale de cette méthode, des cellules E. coli ont été encapsulées dans des microparticules d’agarose, incubées en présence de différentes concentrations de rifampicine et analysées à l’aide de FACS. La concentration minimale inhibitrice de la rifampicine a été déterminée, et les mutants spontanés présentant une résistance aux antibiotiques ont été isolés à l’aide de FACS et caractérisés par séquençage de l’ADN. Grâce à cette approche, le temps et la quantité d’antibiotiques nécessaires pour isoler les mutants ont été réduits de 8 et 150 fois, respectivement, par rapport aux méthodes microbiologiques traditionnelles utilisant des plaques de gélose nutritive. Ainsi, cette méthode est importante dans les domaines de la biologie chimique, de la chimie des produits naturels, ainsi que pour la découverte et la caractérisation de métabolites secondaires biologiquement actifs.

Les approches mentionnées ci-dessus ont été utiles pour limiter la taille, la forme et les attributs physiques (microhabitat) ; cependant, aucune d’entre elles n’a offert la possibilité de déterminer la géométrie 3D des agrégats bactériens ou l’orientation de multiples populations de manière arbitraire. En outre, le processus d’encapsulation des cellules dans des cavités de très faible volume limite souvent le transport de masse, ce qui conduit à des conditions incompatibles avec la croissance et la signalisation entre des populations physiquement isolées. Un nombre croissant de preuves met en évidence l’importance des microcolonies dans la reproduction bactérienne ; cependant, on constate le manque d’outils pour l’évaluation systématique du comportement cellulaire dans ces communautés. De nouvelles stratégies pour la création d’un environnement culturel 3D à l’échelle microscopique peuvent jouer un rôle crucial dans l’identification de la façon dont les bactéries gèrent la résistance aux antibiotiques et d’autres comportements sociaux dans de petits agrégats denses.

Dans Connell et al. et Connell et al. la méthode de formation par laser de chambres 3D microscopiques basée sur la lithographie multiphotonique (MPL) est décrite. La méthode MPL a une capacité à haut débit et la possibilité de produire des motifs arbitraires. Elle offre des possibilités pour la production industrielle de microdispositifs 3D tels que des composants micro-optiques, des échafaudages pour l’ingénierie tissulaire et des puces microfluidiques. Dans l’étude de Connell et al., l’albumine de sérum bovin (BSA), une protéine hautement soluble qui peut être réticulée en hydrogels poreux, durables et biocompatibles, a été utilisée pour créer des chambres bactériennes microscopiques en 3D. Des bactéries distinctes ont été enfermées dans les chambres de BSA avec un volume de 1 pl et ont ensuite été cultivées en populations clonales. En raison de la diffusion de molécules biologiquement significatives et d’antibiotiques à travers les parois de BSA, ainsi que de l’échange de signaux quorum-sensibles, le comportement social des communautés bactériennes a été étudié en fonction de la taille et de la densité de la population, de la forme du récipient et du débit du milieu.

Dans le corps humain, les bactéries existent généralement dans des communautés 3D structurées composées de plusieurs espèces bactériennes. Pour obtenir des informations détaillées sur l’effet de la géométrie sur la pathogénicité, une stratégie d’impression 3D est décrite dans Connell et al. pour les communautés bactériennes, dans laquelle des populations physiquement distinctes mais chimiquement interactives d’une certaine taille, forme et densité peuvent être organisées sous n’importe quelle forme essentiellement (figure 2). Grâce à cette approche, il a été démontré que la stabilité d’une seule espèce pathogène de bactéries à l’antibiotique pouvait renforcer la résistance de la seconde espèce en raison de leurs relations 3D. À l’aide de la technique de lithographie au laser, des récipients microscopiques d’un volume allant jusqu’à 1 pl avec une épaisseur de paroi allant jusqu’à 2 µm autour de bactéries sélectionnées en suspension dans de la gélatine ont été formés par réticulation des molécules polypeptidiques dans la région focale en raison de l’absorption non linéaire du rayonnement laser par les molécules photosensibilisatrices. Le résultat de cette absorption multiphotonique est la formation d’oxygène singulet, qui stimule les réactions de réticulation covalente intramoléculaire et intermoléculaire entre la BSA et la gélatine. Les propriétés physiques et chimiques uniques de la gélatine ont motivé l’intérêt pour son utilisation dans une variété d’applications, y compris le stockage, l’immobilisation et la culture 3D de bactéries. Après élimination de l’excès de réactif, les bactéries sont localisées dans des cavités scellées formées par la gélatine réticulée, qui est un matériau très poreux et permet une croissance rapide des populations cellulaires entièrement enfermées. Elle est facilement perméable aux polypeptides, aux antibiotiques et aux signaux physiques et chimiques à l’aide desquels se produit l’interaction entre les bactéries. L’isolement des cellules dans des microconteneurs offre les possibilités d’encastrement de différents types/densités de conteneurs les uns dans les autres, ainsi que de changements dynamiques dans l’orientation de l’ensemble des populations de bactéries au sein de la communauté.

Les auteurs ont montré que les interactions spatialement localisées du Staphylococcus aureus à Gram positif et de la bactérie P. aeruginosa à Gram négatif (deux pathogènes humains qui forment souvent des coinfections persistantes à l’intérieur des plaies, des cathéters et du poumon des patients atteints de mucoviscidose) peuvent augmenter la survie du Staphylococcus lors du traitement avec les β-lactamines.

L’impression cellulaire micro-3D étend fondamentalement les possibilités de sonder la résistance aux antibiotiques lorsqu’un seul microgroupe bactérien peut affecter la sensibilité aux antibiotiques des populations adjacentes environnantes ou intégrées – une question particulièrement pertinente pour les infections in vivo (par ex, blessures, cavité buccale et fibrose kystique des poumons) où les tissus sont souvent colonisés par plusieurs espèces de bactéries simultanément. Le véritable pouvoir de l’impression cellulaire 3D réside dans la possibilité d’organiser les communautés microbiennes dans une gamme illimitée de géométries. L’impression cellulaire micro-3D peut également être un outil précieux pour l’étude des mécanismes et de la dynamique des réponses adaptatives aux conditions environnementales.