Oreilles bioniques imprimées en 3D | CDhistory

La conception et la mise en œuvre d’organes et de dispositifs bioniques qui améliorent les capacités humaines, connues sous le nom de cybernétique, ont été un domaine d’intérêt scientifique croissant.1,2 Ce domaine a le potentiel de générer des pièces de remplacement personnalisées pour le corps humain, ou même de créer des organes contenant des capacités au-delà de ce que la biologie humaine fournit habituellement. En particulier, le développement d’approches pour l’intégration multidimensionnelle directe de composants électroniques fonctionnels avec des tissus et des organes biologiques pourrait avoir un impact considérable sur la médecine régénérative, les prothèses et les interfaces homme-machine3,4. Récemment, plusieurs rapports ont décrit le couplage de l’électronique et des tissus à l’aide de dispositifs et de capteurs planaires flexibles et/ou étirables qui se conforment aux surfaces des tissus, permettant des applications telles que la détection biochimique et le sondage des activités électriques sur les surfaces du cœur,5 des poumons,6 du cerveau,7 de la peau8 et des dents.9 Cependant, l’obtention de composants électroniques tridimensionnels sans faille entrelacés avec des tissus et des organes biologiques est nettement plus difficile.4

L’ingénierie tissulaire est guidée par le principe selon lequel une variété de types de cellules peuvent être incitées à synthétiser un nouveau tissu si elles sont ensemencées sur un échafaudage d’hydrogel tridimensionnel approprié dans un environnement de croissance accordé.10-15 Après une culture in vivo ou in vitro, des structures tissulaires se forment qui possèdent la morphologie de l’échafaudage original.16 Cependant, un défi majeur dans les approches traditionnelles d’ingénierie tissulaire est la génération d’implants ensemencés de cellules avec des structures qui imitent le tissu natif, à la fois dans les géométries anatomiques et les distributions cellulaires intra-tissulaires.17 Des techniques telles que l’ensemencement de cellules dans des moules non adhésifs ou des échafaudages auto-pliants ont été utilisées pour fabriquer des constructions tissulaires tridimensionnelles avec des géométries complexes en 3D.18,19 Pourtant, les techniques existantes sont encore incapables de créer facilement des parties d’organes ou de tissus avec les hétérogénéités spatiales requises et des géométries anatomiques précises pour répondre à la pénurie d’organes de donneurs pour la transplantation.20-22 Par exemple, la reconstruction totale de l’oreille externe avec du cartilage autogène – avec l’objectif de recréer une oreille qui est similaire en apparence au pavillon controlatéral – reste l’un des problèmes les plus difficiles dans le domaine de la chirurgie plastique et reconstructive23.

Les techniques de fabrication additive telles que l’impression 3D offrent une solution potentielle via la capacité de créer rapidement des modèles de conception assistée par ordinateur (CAO) en les découpant en couches et en construisant les couches vers le haut en utilisant des cellules biologiques comme encres, dans les géométries anatomiques précises des organes humains24.-Des variantes de l’impression 3D ont été utilisées comme méthodes de fabrication de formes libres solides, bien que leur utilisation ait été principalement limitée à la création de pièces mécaniques passives.24,28 L’impression 3D basée sur l’extrusion a été utilisée pour créer des échafaudages de tissus durs tels que des ménisques de genou et des disques intervertébraux avec des cellules encapsulées.29-Cette technique offre la possibilité de créer des structures multi-matériaux spatialement hétérogènes en utilisant des outils de dépôt qui peuvent extruder une large gamme de matériaux.32 De plus, les blocs de construction fonctionnels à l’échelle nanométrique permettent un assemblage ascendant polyvalent de composants à grande échelle possédant des fonctionnalités réglables. Cela pourrait permettre l’impression simultanée de matériaux nanoélectroniques et de cellules biologiques pour produire des tissus et des organes cyborg intégrés en trois dimensions et présentant des capacités uniques.33,34

Nous présentons ici une approche conceptuellement nouvelle qui relève les défis susmentionnés en imbriquant complètement des composants électroniques fonctionnels avec des tissus biologiques via l’impression 3D de matériaux nanoélectroniques et d’hydrogels ensemencés de cellules viables dans les géométries anatomiques précises des organes humains. Les circuits électroniques étant au cœur des dispositifs de traitement des sens et de l’information35, la culture in vitro de l’architecture hybride imprimée permet la croissance d' »organes cyborgs » présentant des fonctionnalités améliorées par rapport à la biologie humaine. Notre approche offre la possibilité de définir et de créer des constructions spatialement hétérogènes en extrudant une large gamme de matériaux dans un processus couche par couche jusqu’à ce que la géométrie stéréolithographique finale soit complète. Ce concept d’impression 3D de cellules vivantes avec des composants électroniques et leur croissance en organes fonctionnels représente une nouvelle direction dans la fusion de l’électronique et des systèmes biologiques. En effet, de tels organes cyborg sont distincts des tissus artificiels ou de l’électronique conformationnelle planaire/flexible et offrent un moyen unique d’atteindre une fusion tridimensionnelle de l’électronique avec les tissus.

Comme preuve de concept de cette approche, nous avons évalué la capacité de l’impression 3D à créer un pavillon d’oreille viable qui contient également de l’électronique permettant des capacités alternatives à l’audition humaine. Les organes humains composés principalement de tissus cartilagineux, tels que le pavillon de l’oreille, représentent des prototypes candidats appropriés pour étudier la faisabilité de notre approche. Ceci est dû à 1) la complexité inhérente à la géométrie anatomique de l’oreille, qui la rend difficile à bio-ingénier via les approches traditionnelles d’ingénierie tissulaire, ainsi qu’à 2) la simplicité de sa structure au niveau du tissu cartilagineux en raison de l’absence de vascularisation.23,36 De plus, l’assemblage ascendant de matrices nanoélectroniques permet de générer hiérarchiquement des composants électroniques fonctionnels à grande échelle. Plus précisément, nous démontrons l’impression 3D d’une matrice d’hydrogel d’alginate ensemencée par des chondrocytes, avec une antenne à bobine inductive infusée de nanoparticules d’argent (AgNP) conductrice d’électricité, connectée à des électrodes en forme de cochlée supportées par du silicone. Pris ensemble, le résultat est une intégration tridimensionnelle de composants électroniques fonctionnels dans la géométrie anatomique complexe et précise d’une oreille humaine (Fig. 1).

Les étapes suivantes sont impliquées dans le processus. Tout d’abord, un dessin CAO de l’oreille bionique (figure 1A) est utilisé pour prescrire la géométrie anatomique et l’hétérogénéité spatiale des différents matériaux fonctionnels. Comme décrit ci-dessus, trois matériaux constituent les trois composants fonctionnels (structurels, biologiques et électroniques) de l’oreille bionique. Ces matériaux sont introduits dans une imprimante 3D Fab@Home à extrusion par seringue (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (Fig. 1B). La construction d’oreille hybride bioélectronique imprimée est ensuite cultivée in vitro pour permettre la croissance du tissu cartilagineux afin de former une oreille cyborg ayant la capacité de détecter les signaux électromagnétiques dans la gamme des fréquences radio (RF) au moyen d’une bobine inductive agissant comme une antenne de réception (figure 1C).

Pour démontrer notre approche, nous avons imprimé la construction d’oreille bionique comme suit. Pour l’échafaudage, nous avons pré-ensemencé une matrice d’hydrogel d’alginate avec des chondrocytes viables à une densité de ~60 millions de cellules/mL (voir Informations complémentaires). La matrice d’alginate est tridimensionnellement stable en culture, non toxique, compatible avec le préensemencement et l’extrusion, et constitue un véhicule d’administration cellulaire approprié car la réticulation peut être initiée avant le dépôt.37 Les chondrocytes utilisés pour l’impression ont été isolés à partir du cartilage articulaire de veaux âgés d’un mois (Astarte Biologics, Redmond, WA). Un dessin CAO d’un pavillon d’oreille humaine au format stéréolithographie (STL) avec une antenne à bobine circulaire intégrée connectée à des électrodes en forme de cochlée a été utilisé pour définir les chemins d’impression en découpant le modèle en couches de contours et de trames de remplissage. La réticulation a été initiée dans la matrice d’hydrogel d’alginate pré-ensemencée avec des chondrocytes viables, qui a ensuite été imprimée en 3D avec des solutions de silicone conductrices (infusées d’AgNP) et non conductrices (film 1). Ensemble, cette méthode a produit les composants biologiques, électroniques et structurels de l’organe bionique en un seul processus.

La figure 2A montre l’oreille bionique imprimée en 3D immédiatement après l’impression. Notamment, on constate qu’elle reproduit fidèlement le dessin CAO, dans la spatialité précise pour chaque matériau tel que dicté par le design. L’oreille imprimée a été immergée dans un milieu de culture de chondrocytes contenant 10 % ou 20 % de sérum bovin fœtal (FBS), qui a été renouvelé tous les 1 à 2 jours (voir les informations complémentaires). L’oreille hybride a montré une bonne intégrité structurelle et une bonne conservation de la forme en culture (Fig. 2B). Au fil du temps, la construction est devenue progressivement plus opaque, ce qui était le plus apparent après quatre semaines de culture, et correspond grossièrement au développement d’une matrice extracellulaire (MEC). La morphologie brute de l’oreille bionique après 10 semaines de culture in vitro est présentée dans les informations complémentaires.

La viabilité a été testée immédiatement avant et pendant les différentes étapes du processus d’impression. La viabilité initiale des cellules a été déterminée après la culture à l’aide d’un test d’exclusion cellulaire au bleu Trypan (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) et s’est avérée être de 96,4 ± 1,7 % (figure 2C) (voir Informations complémentaires). L’oreille en alginate ensemencée de cellules imprimées a également été testée avec un test de viabilité LIVE/DEAD® (Molecular Probes, Eugene, OR) et a présenté une viabilité cellulaire de 91,3 ± 3,9 % avec une distribution homogène des chondrocytes. Ce résultat suggère que le processus d’impression, y compris l’encapsulation et le dépôt des cellules, n’a pas d’impact appréciable sur la viabilité des chondrocytes.

Notamment, cette approche d’impression d’une matrice d’hydrogel pré-ensemencée élimine les principaux problèmes associés aux limitations de profondeur d’ensemencement et à l’ensemencement non uniforme dans les méthodes traditionnelles d’ensemencement des échafaudages 3D prémoulés. L’ensemencement de chondrocytes dans une matrice d’alginate bioabsorbable et sa mise en forme par impression 3D permet de localiser les cellules dans une géométrie souhaitée, ce qui permet la production de nouveaux ECM à des endroits définis lors de la culture dans des milieux nutritifs. À mesure que le tissu se développe, l’échafaudage polymère est réabsorbé (figure 2D), de sorte que le nouveau tissu conserve la forme du polymère dans lequel les cellules ont été ensemencées. L’échafaudage biodégradable offre à chaque cellule un meilleur accès aux nutriments et une élimination plus efficace des déchets.

Puis, une évaluation histologique a été utilisée pour comparer la morphologie des chondrocytes dans le néocartilage de l’oreille bionique à celle du tissu cartilagineux natif. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a révélé une distribution uniforme des chondrocytes dans les constructions (Fig. 2E) (voir les informations complémentaires). L’histologie du tissu de l’oreille avec la coloration à la Safranine O a indiqué une accumulation relativement uniforme des protéoglycanes dans le tissu de l’oreille cultivé (Fig. 2F). Ces données biochimiques sont cohérentes avec le développement d’un nouveau cartilage.38 Enfin, des mesures de fluorescence ont été utilisées pour vérifier la viabilité du tissu d’oreille bionique imprimé en 3D après 10 semaines de culture in vitro en utilisant des colorations au diacétate de fluorescéine (FDA) et à l’iodure de propidium (PI). Les figures 2G et 2H montrent respectivement le tissu recouvrant l’antenne de la bobine et le tissu interne en contact avec l’électrode qui traverse perpendiculairement le tissu. Dans les deux cas, le cartilage cultivé présentait une excellente morphologie et une viabilité au niveau du tissu. Notamment, cette approche de culture de tissu en présence de matériaux électroniques abiotiques pourrait minimiser la réponse immunitaire du tissu cultivé.

Nous avons ensuite caractérisé les propriétés mécaniques du cartilage à différents stades de croissance, car le développement de l’ECM est fortement corrélé aux propriétés mécaniques du tissu en développement.39 Tout d’abord, des caractérisations biochimiques et histologiques approfondies ont été réalisées. Des échantillons ont été prélevés dans des cultures contenant 10 % et 20 % de FBS à 2, 4, 6, 8 et 10 semaines et congelés pour mesurer la teneur en ADN du néocartilage et pour l’évaluation biochimique de l’ECM (voir les informations complémentaires). L’accumulation d’ECM dans les constructions a été évaluée en quantifiant la quantité de deux composants importants de l’ECM : 1) l’hydroxyproline (HYP) comme marqueur de la teneur en collagène, et 2) le glycosaminoglycane sulfaté (GAG) comme marqueur des protéoglycanes. À la semaine 10, la teneur en HYP a augmenté à 1,2 ± 0,1 μg/mg et 1,4 ± 0,2 μg/mg pour les cultures contenant 10 % et 20 % de FBS, respectivement (figure 3A). Les valeurs correspondantes de la teneur en GAG pour la semaine 10 étaient de 10,6 ± 0,6 μg/mg et 12,2 ± 1,0 μg/mg (figure 3B). Cette augmentation de la teneur en GAG et en HYP indique que les chondrocytes sont vivants et métaboliquement actifs en culture.

Puis, les propriétés de traction ont été analysées en testant des échantillons d’os de chien chondrocytes-alginate imprimés en 3D à différents points de la culture, dans lesquels les os de chien contenaient les mêmes densités de cellules et des conditions de culture identiques à celles de l’oreille (Voir Informations complémentaires). L’évaluation des propriétés mécaniques a montré que le module d’Young des os à mâchoires augmentait avec le temps, passant de 14,16 kPa à 111,46 kPa à la dixième semaine (figure 3C). Des os de chien d’une densité de chondrocytes inférieure (20 millions de cellules/mL) ont également été testés dans des conditions similaires afin de comprendre l’effet de la densité initiale de chondrocytes sur les propriétés mécaniques du tissu cultivé. On a constaté que ces tissus possédaient un module d’Young inférieur de 73,26 kPa à la semaine 10. Ensuite, la dureté du tissu cartilagineux cultivé de l’oreillette imprimée en 3D a été caractérisée par des mesures de nanoindentation. Les indentations ont été réalisées sur les différents sites anatomiques du pavillon de l’oreille (Fig. 3D). Comme le montre le tableau 1, ces valeurs de dureté se sont avérées relativement uniformes, allant de 38,50 kPa à 46,80 kPa, confirmant l’intégrité structurelle de l’oreille imprimée40.

Pour démontrer les fonctionnalités améliorées de l’oreille bionique imprimée en 3D, nous avons effectué une série de caractérisations électriques. Tout d’abord, la résistivité de l’antenne de la bobine a été mesurée à l’aide de mesures de sonde à quatre points et s’est avérée dépendre du débit volumétrique utilisé pour imprimer le silicone conducteur infusé d’AgNP (voir Informations complémentaires). Au débit optimal, la résistivité de la bobine imprimée s’est avérée être de 1,31 × 10-6 Ω-m, ce qui est seulement deux ordres de grandeur plus élevés que l’argent pur (1,59 × 10-8 Ω-m). Ensuite, nous avons réalisé des expériences de réception de radiofréquences sans fil. Pour démontrer la capacité de l’oreille bionique à recevoir des signaux au-delà des fréquences normales des signaux audibles (chez l’homme, 20 Hz à 20 kHz), nous avons formé des connexions externes aux électrodes en forme de cochlée issues de la bobine inductive de l’oreille bionique (figure 4A). L’oreille a ensuite été exposée à des ondes sinusoïdales de fréquences allant de 1 MHz à 5 GHz. Le paramètre S21 (coefficient de transmission directe) de l’antenne de la bobine a été analysé à l’aide d’un analyseur de réseau et s’est avéré transmettre des signaux sur ce spectre de fréquences étendu (figure 4B).

Plus important encore, comme exemple démonstratif de la polyvalence de la modification de l’organe final en modifiant la conception CAO, nous avons imprimé une oreille gauche complémentaire en reflétant simplement le modèle original (voir Informations complémentaires). Les canaux gauche et droit d’un signal audio stéréophonique ont été transmis à l’oreille bionique gauche et droite par l’intermédiaire d’antennes à boucle magnétique avec noyau de ferrite (figure 4C). Les signaux reçus par les oreilles bioniques ont été collectés à partir de la sortie de signal des électrodes doubles en forme de cochlée et introduits dans un oscilloscope numérique, puis restitués par un haut-parleur pour un contrôle auditif et visuel. Des extraits des signaux transmis et reçus d’une durée de 1 ms pour les oreilles bioniques droite et gauche sont illustrés à la figure 4D et présentent une excellente reproduction du signal audio. De manière significative, la musique jouée (Für Elise de Beethoven) à partir du signal reçu par les oreilles bioniques possédait une bonne qualité sonore (film 2).

En résumé, des « oreilles cyborg » ont été fabriquées et sont capables de recevoir des signaux électromagnétiques sur une large gamme de fréquences allant de Hz à GHz. Notre stratégie représente une preuve de principe de l’entrelacement de la polyvalence des techniques de fabrication additive avec l’assemblage de nanoparticules et les concepts d’ingénierie tissulaire. Le résultat est la génération d’organes bioniques authentiques, tant sur le plan de la forme que de la fonction, validés par des tests d’ingénierie tissulaire et des mesures électriques. Ces hybrides se distinguent des tissus artificiels ou de l’électronique planaire/flexible et offrent un moyen unique de réaliser une intégration transparente de l’électronique avec les tissus pour générer des organes cyborg « prêts à l’emploi ». Enfin, l’utilisation de l’impression 3D avec d’autres classes de blocs de construction fonctionnels à l’échelle nanométrique, y compris les nanoparticules semi-conductrices, magnétiques, plasmoniques et ferroélectriques, pourrait élargir les possibilités d’ingénierie des tissus et des organes bioniques.