Puisque la quantification précise des protéines est essentielle à toutes les expériences liées aux études sur les protéines, différentes méthodes ont été développées pour mesurer la concentration des protéines dans un essai donné. Certaines des méthodes les plus traditionnelles de quantification des protéines totales comprennent la mesure de l’absorbance UV à 280 nm (A280), l’acide bicinchoninique (BCA) et les essais de Bradford, et d’autres méthodes alternatives telles que les essais de Lowry et d’autres nouveaux essais.
Puisque les protéines absorbent la lumière à une longueur d’onde spécifique, la mesure peut être obtenue en utilisant un spectrophotomètre. Plus précisément, les acides aminés tyrosine et tryptophane ont une absorption très spécifique à 280 nm, ce qui permet une mesure directe A280 de la concentration des protéines.
L’absorbance UV à 280 nm est couramment utilisée pour estimer la concentration des protéines dans les laboratoires en raison de sa simplicité, de sa facilité d’utilisation et de son coût abordable. Les mesures sont rapides et hautement reproductibles puisqu’il n’y a pas besoin d’incubation. En outre, cette méthode nécessite également un volume d’échantillon extrêmement faible puisque les spectrophotomètres modernes utilisent un système de rétention de l’échantillon pendant la mesure.
Il faut cependant veiller à ce que l’échantillon de protéines ne contienne pas de composants non protéiques (par exemple des acides nucléiques) ayant le même spectre d’absorption car cela peut conduire à des résultats erronés. En dehors de la détermination des concentrations de protéines, les valeurs d’absorbance peuvent également être utilisées pour détecter les changements de conformation et la liaison des ligands et pour suivre les réactions enzymatiques.
L’effet du tryptophane et de la tyrosine dans la quantification des protéines
En raison de la présence de tyrosine et de tryptophane, les protéines et les peptides contenant ces acides aminés aromatiques absorbent la lumière UV à une longueur d’onde de 280 nm. Chacun de ces résidus présente des longueurs d’onde d’absorption et d’émission distinctes et varie en termes de rendements quantiques. La phénylalanine et les liaisons disulfure contribuent également à l’absorption à cette longueur d’onde, mais comme elle est relativement insignifiante, elle ne peut être observée qu’en l’absence de tryptophane et de tyrosine.
De nombreux cofacteurs enzymatiques contenant des structures cycliques aromatiques (par exemple FMN, FAD, NAD et porphyrines) absorbent également la lumière UV pour l’excitation et ajoutent donc à l’intensité de la fluorescence résultante. Des protéines spéciales telles que la protéine fluorescente verte ont également une séquence interne sérinetyrosine-glycine qui est modifiée post-traductionnellement et qui est fluorescente dans la région de la lumière visible.
Tryptophane
Le tryptophane est significativement plus fluorescent que la tyrosine et la phénylalanine. Cependant, ses propriétés fluorescentes sont dépendantes du solvant, c’est-à-dire que le spectre se déplace vers des longueurs d’onde plus courtes et augmente en intensité lorsque la polarité du solvant diminue. À ce titre, les résidus de tryptophane enfouis dans les domaines hydrophobes des protéines repliées présentent un décalage spectral de 10 à 20 nm.
En raison de sa plus grande absorptivité, de son rendement quantique plus élevé et du transfert d’énergie de résonance, le spectre de fluorescence d’une protéine contenant les trois acides aminés ressemble généralement à celui du tryptophane.
Tyrosine
La tyrosine peut être excitée à des longueurs d’onde similaires à celle du tryptophane mais émettra à une longueur d’onde nettement différente. S’il est vrai que la tyrosine est moins fluorescente que le tryptophane, elle peut fournir un signal important car elle est souvent présente en grand nombre dans de nombreuses protéines. On a observé que la fluorescence de la tyrosine était éteinte par la présence de fragments de tryptophane à proximité, soit par transfert d’énergie de résonance, soit par ionisation de son groupe hydroxyle aromatique.
Voici quelques points importants à retenir lors de la mesure des peptides par la méthode A280.
- Des protéines de poids moléculaire similaire peuvent avoir des valeurs d’absorbance différentes en raison de la différence de teneur en tryptophane et en tyrosine.
- L’absorbance UV est également affectée par la structure des protéines. Ainsi, les conditions qui affectent la structure (comme la température, le pH, la force ionique ou la présence de détergents) peuvent affecter la capacité des résidus aromatiques à absorber la lumière à 280 nm, et modifier la valeur du coefficient d’extinction de la protéine.
- L’environnement local des acides aminés aromatiques peut avoir un effet sur leurs spectres. Ainsi, le tryptophane aura un pic d’émission à des longueurs d’onde plus faibles lorsqu’il est enfoui dans les régions internes hydrophobes d’une protéine, tandis que la tyrosine transférera souvent son énergie aux acides aminés tryptophanes adjacents. Le tyrosinate ionisé, qui se forme lorsque des protons sont perdus par la tyrosine en raison de l’augmentation du pH, démontrera des longueurs d’onde similaires à celles du tryptophane.