Production efficace d’acide 3-hydroxypropionique à partir de glycérol par Klebsiella pneumoniae métaboliquement modifié

Dans la production de 1,3-propanediol ou 3-HP à partir de glycérol, l’acide lactique est le principal sous-produit qui réduit considérablement le rendement du produit. Par conséquent, des tentatives ont été faites pour réduire la production de lactate par la délétion du gène codant pour la lactate déshydrogénase (Kumar et al. 2013b ; Zhong et al. 2014). Comme les deux réactions formant le 1,3-propanediol et le 3-HP sont en compétition pour leur substrat commun, le 3-hydroxyaldéhyde (3-HPA), la délétion de la propanediol oxydoréductase favorise la production de 3-HP (Ashok et al. 2011). Par conséquent, dans cette étude, les gènes ldhA et dhaT ont été knockés pour améliorer la production de 3-HP.

Effet de la déficience en ldhA sur la production de 3-HP

La souche déficiente en ldhA JJQ01 a été construite et le knockout de ldhA a été confirmé comme le montre la figure S2A. Les souches recombinantes Kp4(pUC18-kan-aldH) et JJQ01(pUC18-kan-aldH) ont été construites et des fermentations fed-batch ont été effectuées dans le bioréacteur de 5 L. Les profils de la croissance cellulaire, de la production de glycérol et de la production d’acides aminés ont été analysés. Les profils de croissance cellulaire, de consommation de glycérol et de production de métabolites sont présentés dans les Fig. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) a produit 18,3 g/L de 3-HP avec un rendement de 0,21 mol/mol en 38 h, tandis que l’acide lactique a atteint 32,2 g/L avec un rendement plus élevé de 0,34 mol/mol. En outre, 17,6 g/L de 2,3-butanediol, 6,1 g/L de 1,3-propanediol et 10,7 g/L d’acide acétique ont été produits. La formation de lactate augmente non seulement le coût, mais aussi la difficulté de récupérer la 3-HP, qui est un isomère du lactate. De plus, le lactate est un inhibiteur principal de la biosynthèse du 3-HP et du 1,3-propanediol (Xu et al. 2009b ; Kumar et al. 2013b). La déficience en ldhA a éliminé efficacement la formation de lactate et la production de 3-HP a atteint 48,3 g/L avec un rendement de 0,28 mol/mol, comme le montre la figure 2b. La concentration et le rendement de 3-HP dans cette souche déficiente en ldhA ont été augmentés de 1,64 fois et de 33,3 %, respectivement, par rapport à la souche Kp4(pUC18-kan-aldH). À l’exception de la petite quantité de formation d’éthanol (environ 4 g/L), l’accumulation de pyruvate et de formate par la souche mutante ldhA n’a pas été détectée, qui n’ont presque pas été observées dans le cas de l’utilisation de la souche de type sauvage.

Ces résultats indiquent clairement que le blocage de la production d’acide lactique a grandement redirigé le flux de carbone vers la production de 3-HP. L’assimilation du glycérol par la DhaB a été significativement améliorée, près de 0,4 mol/mol de glycérol a été dirigé par la DhaB vers le 3-HPA, ce qui était cohérent avec d’autres études (Kumar et al. 2013b ; Xu et al. 2009b). La réduction du lactate pourrait diminuer la toxicité pour les cellules, favoriser la croissance cellulaire et la productivité de la 3-HP. Cependant, la réduction du lactate a également augmenté la formation de 2,3-butanediol et de 1,3-propanediol, qui ont atteint 21,9 g/L avec un rendement de 0,13 mol/mol et 18,5 g/L avec un rendement de 0,12 mol/mol, respectivement. En raison de la délétion de ldhA, l’excès de NADH provenant de l’accumulation accrue de 3-HP pourrait favoriser la production de 2,3-butanediol et de 1,3-propanediol au lieu du lactate pour régénérer le NAD+ et maintenir l’équilibre redox. En fait, la formation d’éthanol a également soutenu la régénération de NAD+, ce qui a entraîné un flux plus élevé du pyruvate vers l’éthanol que le flux vers le pyruvate.

Effet de la déficience en dhaT sur la production de 3-HP

La délétion de ldhA a considérablement augmenté la production de 3-HP, en même temps, la production de 1,3-propanediol a également été augmentée à 18,5 g/L. Ko et al. (2017) ont signalé que 43 g/L de 3-HP et 21 g/L de 1,3-propanediol ont été obtenus en réduisant l’acétate et d’autres sous-produits. Bien que la formation du 1,3-propanediol profite à l’utilisation du glycérol en régénérant le cofacteur, elle représente une partie substantielle du flux de carbone du glycérol. Étant donné que le 1,3-propanediol et le 3-HP sont en compétition pour le même précurseur, le 3-HPA, la souche JJQ02(pUC18-kan-aldH) a été construite pour limiter le flux vers le 1,3-propanediol, en raison d’un double-knockout de ldhA et dhaT (présenté dans le fichier additionnel 1 : Figure S2B). Les résultats de la fermentation en lots dans le réacteur de 5 litres sont présentés à la figure 2c. De façon inattendue, la suppression concomitante de ldhA et de dhaT n’a permis d’obtenir que 44,5 g/L de 3-HP, même si le rendement a été augmenté à 0,32 mol/mol de glycérol. La délétion de dhaT a entraîné une réduction du titre et du rendement du 1,3-propanediol à 9,9 g/L et 0,07 mol/mol, respectivement. Mais le 1,3-propanediol était toujours produit dans la réaction catalysée par YqhD et d’autres oxydoréductases (Ashok et al. 2013). En outre, par rapport à JJQ01(pUC18-kan-aldH), la production de 2,3-butanediol a légèrement augmenté de 21,9 à 23,4 g/L, ce qui indique que le flux vers la voie du 2,3-butanediol a été augmenté pour consommer l’excès de NADH dérivé de la réaction catalysée par l’ALDH. La synthèse du 1,3-propanediol joue un rôle clé dans la régulation de l’équilibre redox chez K. pneumoniae. Dans la voie d’oxydation, la formation d’une molécule d’acétate à partir du glycérol produit trois molécules de NADH, en même temps qu’une molécule d’ATP est formée. Par conséquent, la délétion de ldhA et de dhaT a considérablement réduit la capacité de régénération du NAD+, et davantage de NADH a été oxydé par la formation de 2,3-butanediol, ce qui a entraîné une augmentation du 2,3-butanediol. En réduisant le taux d’aération (en limitant l’apport d’oxygène), on pouvait augmenter la production d’acétate pour fournir plus d’ATP, mais en même temps, plus de NADH était formé, ce qui augmentait encore la production de 2,3-butanediol. Cependant, le NAD+ régénéré semble être inférieur à celui formé dans la réaction catalysée par la DhaT, ce qui entraîne une production plus faible de 3-HP. Par conséquent, la fourniture d’une quantité appropriée d’oxygène pour générer du NAD+ sans affecter l’activité de DhaB et la dissimilation du glycérol est critique pour la production de 3-HP dans la fermentation micro-aérobie.

Dans cette étude, il n’a pas réussi à améliorer le 3-HP en supprimant le gène dhaT. La dissimilation du glycérol est régulée par la glycérol déshydrogénase DhaD, la glycérol kinase GlpK, la glycérol déshydratase DhaB et les 1,3-propanediol oxydoréductases 1,3-PDORs. La rigidité du point de branchement du glycérol implique que l’amélioration de la production de 3-HP par la délétion de gènes impliqués dans la répartition du flux de glycérol est difficile. Ashok et al. (2011) ont déterminé les activités inhérentes de DhaD, DhaB, ALDH et 1,3-PDORs après la délétion du gène dhaT. Ils ont constaté que l’activité de la DhaD était légèrement améliorée, l’activité de l’ALDH légèrement diminuée et l’activité de la DhaB significativement diminuée. Zhang et al. (2008) ont également analysé la robustesse aux points de ramification de la voie de dissimilation du glycérol. Il a été montré que le partage du flux de carbone entre la branche réductrice et la branche oxydante était robuste face aux conditions environnementales.

Effet de l’aération sur la production de 3-HP

Nos études précédentes ont montré que la condition micro-aérobie était favorable à la production de 3-HP. Par rapport au processus anaérobie, dans la fermentation micro-aérobie, la production de 3-HP était significativement augmentée en raison du niveau d’expression plus élevé de l’aldéhyde déshydrogénase, et en même temps, la production de 1,3-propanediol était réduite (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) ont signalé que l’activité spécifique de la glycérol déshydratase chez K. pneumoniae à un taux d’aération de 0,04 vvm était 59 % plus élevée que celle en l’absence d’apport d’air. Cependant, il a été rapporté que la glycérol déshydratase peut être rapidement inactivée par l’oxygène (Toraya 2000 ; Ruch et Lin 1975), et affecter la production de 3-HP de manière significative (Xu et al. 2009a ; Huang et al. 2013 ; Niu et al. 2017). De plus, la coenzyme B12, le cofacteur de la DhaB, n’est pas suffisamment synthétisée dans des conditions d’aération élevée chez la plupart des producteurs naturels de 3-HPA tels que K. pneumoniae. Huang et al. (2013) et Ko et al. (2017) ont également montré que les conditions hautement aérobies n’étaient pas bénéfiques pour la production de 3-HP. Par conséquent, nous avons entrepris des expériences préliminaires en fed-batch dans différentes conditions d’aération et avons également constaté que le maintien d’un taux d’aération élevé était défavorable à la production de 3-HP après l’arrêt de la croissance cellulaire (données non présentées). Dans la culture fed-batch de JJQ02(pUC18-kan-aldH), nous avons adopté un taux d’aération égal à la moitié du taux initial lorsque la DO650 était fermée à la valeur maximale. Les profils de croissance, de glycérol et de métabolites sont présentés dans la Fig. 3, et la flèche noire a indiqué le point de temps pour diminuer le taux d’aération (0,5 vvm).

Le titre final de 3-HP a atteint 61.9 g/L avec un rendement de 0,58 mol/mol dans le réacteur de 5 L en 38 h. La concentration et le rendement en 3-HP par JJQ02(pUC18-kan-aldH) étaient 3,3 et 2,76 fois supérieurs à ceux de Kp4 (pUC18-kan-aldH), et 1,28 et 2,07 fois supérieurs à ceux de JJQ01(pUC18-kan-aldH). Les résultats ont montré que la production de 1,3-propanediol et de 2,3-butanediol s’est arrêtée à 20 h. Cependant, le titre de 3-HP a continué à augmenter bien que le taux de production ait diminué à partir de ce moment. Dans la dernière partie de la fermentation micro-aérobie, bien que peu de NADH ait été régénéré par la formation de 1,3-propanediol et de 2,3-butanediol, une partie du NADH a pu être régénérée par la chaîne de transport d’électrons, car le moyen le plus efficace de régénérer le NAD+ est la chaîne de transport d’électrons en présence d’oxygène (Richardson 2000 ; Kumar et al. 2013b), résultant l’augmentation de 3-HP sans augmentation évidente de 1,3-propanediol et de 2,3-butanediol.

Fermentation à l’échelle 300-L

Pour examiner la faisabilité de la souche JJQ02(pUC18-kan-aldH) pour la production de 3-HP dans un bioréacteur plus grand, une fermentation fed-batch a été réalisée dans un bioréacteur de 300-L en suivant les conditions de fermentation établies dans le fermenteur de 5-L. Une stratégie d’aération en deux étapes a été adoptée ; le taux d’aération a été réduit de moitié au moment de la flèche noire, comme le montre la Fig. 4. Le 3-HP a atteint 54,5 g/L avec un rendement de 0,43 mol/mol, et la concentration et le rendement étaient de 12,2 g/L et 0,11 mol/mol pour le 1,3-propanediol, 21,3 g/L et 0.17 mol/mol pour le 2,3-butanediol, et 9,3 g/L et 0,11 mol/mol pour l’acétate en 51 h (Fig. 4).

Par rapport aux résultats obtenus dans le réacteur 5-L, le titre et le rendement molaire du 2,3-butanediol dans le réacteur 300-L étaient manifestement augmentés, qui étaient similaires à ceux avec la même souche dans le réacteur 5-L à un taux d’aération constant de 1 vvm. Cela implique que le transfert d’oxygène dans le réacteur de 300 litres pourrait être un peu plus élevé que dans le réacteur de 5 litres avec un taux d’aération réduit, car certaines recherches ont indiqué que la production de 2,3-butanediol nécessite un taux d’aération approprié (Cheng et al. 2004 ; Shi et al. 2014 ; Xu et al. 2014). Dans la condition d’aération du réacteur de 300 L, l’expression des enzymes liées à la formation du 2,3-butanediol et le pool de NADH ou le rapport NADH/NAD+ ont favorisé la production de 2,3-butanediol, et l’expression de DhaB et AldH pourrait être légèrement affectée.

En vue de l’équilibre redox, dans la souche double-mutante ldhA dhaT, le NADH formé dans la réaction catalysée par l’ALDH était en partie régénéré par la formation de 2,3-butanediol et d’autres métabolites réduits tels que l’éthanol et le succinate, et en partie par la chaîne de transport des électrons (Richardson 2000 ; Kumar et al. 2013b). Par conséquent, le taux d’aération dans la fermentation par micro-aération a affecté de manière significative les produits finaux. Lors de la fermentation dans le réacteur de 300 litres, bien que le taux d’aération ait été réduit de moitié par rapport au taux initial, la situation du transfert d’oxygène peut encore être très différente de celle du réacteur de 5 litres en raison des différentes caractéristiques de transfert d’oxygène, un sujet traditionnel dans la mise à l’échelle des bioprocédés. Les différences de distribution des produits dans les différents réacteurs indiquaient l’importance d’un contrôle précis de l’apport d’oxygène, alors que la seule réduction du taux d’aération semblait trop approximative. Cependant, bien que le titre et le rendement en 3-HP aient été légèrement différents de ceux obtenus dans le réacteur de 5 litres, la mise à l’échelle a été un succès. Puisque la performance du transfert d’oxygène dans le réacteur de 300 L était différente de celle du réacteur de 5 L, on s’attendait à ce qu’une régulation plus précise du taux d’aération dans le réacteur de 300 L puisse améliorer le niveau de 3-HP.