L’analyse des molécules clés du système endocannabinoïde (EC), le 2-arachidonoyl glycérol (2AG) et l’arachidonoyl éthanolamide (anandamide, AEA), est un défi en raison de plusieurs particularités. Le 2AG s’isomérise spontanément en son analogue biologiquement inactif, le 1-arachidonoyl glycérol (1AG), par migration acylique, et il ne peut être distingué du 1AG que par chromatographie. Les effets de matrice causés principalement par les phospholipides co-extraits peuvent compromettre davantage l’analyse. En outre, le 2AG et le 1AG sont instables dans certaines conditions comme l’évaporation du solvant ou la reconstitution d’extraits séchés. Nous avons examiné les effets de différents solvants organiques et de leurs mélanges, comme le toluène, l’acétate d’éthyle et le chloroforme-méthanol, sur l’isomérisation du 2AG/1AG, la stabilité du 2AG/1AG et les effets de matrice dans l’analyse UPLC-MS/MS du 2AG et de l’AEA dans le plasma humain. Le toluène a empêché, à la fois, l’isomérisation du 2AG en 1AG et la dégradation du 2AG/1AG pendant l’évaporation. Les extraits de toluène ne contiennent que 2 % des phospholipides plasmatiques responsables de l’effet de matrice par rapport aux extraits du mélange de solvants chloroforme-méthanol traditionnellement utilisé. Le toluène et tous les autres solvants organiques testés fournissent des rendements d’extraction de 2AG et d’AEA comparables (60-80%). Sur la base de ces propriétés favorables du toluène, nous avons mis au point et validé une méthode UPLC-MS/MS avec ionisation positive par électrospray (ESI+) qui permet de mesurer simultanément, avec exactitude et précision, le 2AG et l’AEA dans le plasma humain. La méthode UPLC-MS/MS a fait l’objet d’une validation croisée avec une méthode GC-MS/MS entièrement validée précédemment décrite pour l’AEA dans le plasma humain. Une corrélation étroite (r(2)=0,821) a été observée entre les résultats obtenus par les méthodes UPLC-MS/MS (y) et GC-MS/MS (x) (y=0,01+0,85x). La méthode UPLC-MS/MS est adaptée à la mesure de routine du 2AG et de l’AEA dans des échantillons de plasma humain (1 ml) en milieu clinique, comme le montrent les échantillons de plasma de contrôle de qualité traités sur une période de 100 jours. La méthode UPLC-MS/MS a été étendue à l’urine humaine. Dans l’urine, l’AEA n’était pas détectable et le 2AG n’a été détecté que dans 3 des 19 échantillons de sujets sains à 160, 180 et 212 pM correspondant à 12,3, 14,5 et 9,9 pmol/mmol de créatinine, respectivement.