Régulation des enzymes de conversion de l’acétate et de l’acétyl-.CoA converting enzymes pendant la croissance sur acétate et/ou glucose dans l’archaeon halophile Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui a formé de l’acétate pendant la croissance aérobie sur le glucose et a utilisé l’acétate comme substrat de croissance. Sur les mélanges glucose/acétate, une croissance diauxique a été observée avec le glucose comme substrat préféré. La régulation des activités enzymatiques, liées au métabolisme du glucose et de l’acétate, a été analysée. On a constaté que la glucose déshydrogénase (GDH) et l’acétyl-CoA synthétase formant de l’ADP (ACD) étaient régulées à la hausse pendant les périodes de consommation de glucose et de formation d’acétate, tandis que l’acétyl-CoA synthétase formant de l’AMP (ACS) et la malate synthétase (MS) étaient régulées à la baisse. Inversement, la régulation positive de l’ACS et de la MS et la régulation négative de l’ACD et de la GDH ont été observées pendant les périodes de consommation d’acétate. La MS était également régulée à la hausse pendant la croissance sur les peptides en l’absence d’acétate. À partir de ces données, nous concluons qu’une ACD inductible par le glucose catalyse la formation d’acétate alors que l’activation de l’acétate est catalysée par une ACS inductible par l’acétate ; l’ACS et la MS sont apparemment induites par l’acétate et réprimées par le glucose.

1 Introduction

Diverses archées halophiles, dont Haloarcula marismortui, se développent sur le glucose, qui est dégradé via une voie Entner-Doudoroff (ED) modifiée et semi-phosphorylée . Il a été démontré que pendant la croissance exponentielle sur le glucose, des quantités significatives d’acétate étaient formées . Des études récentes indiquent que la formation d’acétate à partir d’acétyl-CoA chez les archées halophiles est catalysée par une acétyl-CoA synthétase (ACD) formant de l’ADP (acétyl-CoA + ADP + Pi⇆ acétate + ATP + CoA). Cette synthétase inhabituelle a été trouvée dans toutes les archées formant de l’acétate, y compris les hyperthermophiles anaérobies, et représente un nouveau mécanisme chez les procaryotes de formation d’acétate et de synthèse d’ATP. Dans les archées hyperthermophiles anaérobies, par exemple Pyrococcus furiosus, l’ACD représente la principale réaction de conservation de l’énergie pendant le métabolisme des sucres, du pyruvate et des peptides. Contrairement au mécanisme mono-enzyme des archées, toutes les bactéries utilisent le mécanisme « classique » à deux enzymes pour la conversion de l’acétyl-CoA en acétate, impliquant la phosphate acétyltransférase (PTA) et l’acétate kinase (AK) .

Plusieurs haloarchaea, y compris H. marismortui, Haloferax volcanii et Halorubrum saccharovorum ont été signalés pour se développer sur l’acétate comme substrat. Le métabolisme de l’acétate est initié par son activation en acétyl-CoA. Récemment, nous avons fourni les premières preuves que l’activation de l’acétate en acétyl-CoA chez les haloarchaea est catalysée par une acétyl-CoA synthétase (ACS) formant de l’AMP (acétate + ATP + CoA → acétyl-CoA + AMP + PPi) . L’ACS est la principale enzyme d’activation de l’acétate pour la plupart des organismes utilisant l’acétate dans les trois domaines de la vie . Seules quelques bactéries, par exemple Corynebacterium glutamicum, et aussi l’archée méthanogène acétoclastique Methanosarcina ssp. activent l’acétate en acétyl-CoA via le couple AK/PTA . Ainsi, la voie AK/PTA peut fonctionner de manière réversible in vivo, c’est-à-dire aussi bien dans le sens de la formation de l’acétate que dans le sens de l’activation de l’acétate. En revanche, les premières analyses suggèrent que chez les haloarchées, l’ACD, l’homologue archaïque du couple AK/PTA, fonctionne in vivo dans le sens de la formation de l’acétate, bien que l’enzyme catalyse une réaction réversible in vitro.

Pour élucider davantage le rôle physiologique et avoir un premier aperçu de la régulation dépendante du substrat des enzymes de conversion de l’acétate et de l’acétyl-CoA chez les haloarchaea, nous avons réalisé des expériences de déplacement du substrat avec H. marismortui, et analysé la croissance sur le glucose, l’acétate, les mélanges glucose/acétate et les peptides. Pendant la croissance, les profils d’activité des enzymes de conversion de l’acétate et de l’acétyl-CoA, ACD et ACS, ainsi que de la glucose déshydrogénase, la première enzyme de la dégradation du glucose par la voie ED modifiée, ont été analysés. En outre, les activités de la malate synthase, une enzyme clé du cycle du glyoxylate, proposée pour être opérante dans les haloarchaea , ont été déterminées.

2 Matériaux et méthodes

2.1 Croissance de H. marismortui sur glucose, acétate, mélanges glucose/acétate et sur peptides

Haloarcula marismortui a été cultivé en aérobie à 37 °C sur un milieu complexe contenant de l’extrait de levure, des casaminoacides et en plus du glucose et/ou de l’acétate comme décrit précédemment . Pour la croissance sur le mélange glucose/acétate, ce milieu a été complété par 12,5 mM de glucose et 30 mM d’acétate. La croissance sur les peptides a été réalisée sur le milieu complexe en l’absence d’acétate et de glucose. Les expériences de croissance ont été réalisées dans des fermenteurs de 2 l (fairmen tec, Allemagne) avec une vitesse d’agitation de 500 rpm et un débit d’air comprimé de 600 ml par minute. La croissance a été suivie en mesurant la densité optique à 578 nm (ΔOD578). Un ΔOD578 de 1 correspondait à une teneur en protéines de 0,5-0,6 mg/ml. Le glucose et l’acétate ont été déterminés par voie enzymatique comme décrit dans .

2.2 Préparation des extraits cellulaires

À différentes phases de croissance, les cellules de H. marismortui (100-200 ml de la culture) ont été récoltées et les extraits cellulaires ont été préparés comme décrit dans . Les protéines ont été déterminées par la méthode Bradford en utilisant l’albumine de sérum bovin comme standard.

2.3 Détermination des activités enzymatiques

Tous les dosages enzymatiques ont été réalisés en conditions aérobies à 37 °C dans des cuvettes remplies de 1 ml de mélange de dosage. Les enzymes auxiliaires ont généralement été ajoutées peu avant le début de la réaction et on s’est assuré que ces enzymes ne limitaient pas la vitesse. Une unité (1 U) d’activité enzymatique est définie comme 1 μmol de substrat consommé ou de produit formé par minute.

• Acétyl-CoA synthétase (formant de l’ADP) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) a été mesurée comme décrit dans .

• Acétyl-CoA synthétase (formant de l’AMP) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) a été contrôlée comme la libération de l’HSCoA dépendant de l’AMP et de l’PPi à partir de l’acétyl-CoA selon Srere et al. avec le réactif thiol d’Ellman, le 5′5-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB), en mesurant la formation de l’anion thiophénolate à 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). Le mélange de dosage contenait 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 0,1 mM de DTNB, 1 mM d’acétyl-CoA, 2 mM d’AMP, 2 mM de PPi et de l’extrait.

• La malate synthase (E.C. 4.1.3.2.) a été contrôlée dans un dosage modifié selon Serrano et al. avec du DTNB. Le mélange de dosage contenait 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acétyl-CoA, 0,5 mM glyoxylate et extrait.

• Glucose déshydrogénase (E.C. 1.1.1.47) a été mesuré selon Johnsen et al. .

• Acétate kinase (E.C. 2.7.2.1.) a été mesurée comme décrit dans .

• Phosphotransacétylase (E.C. 2.3.1.8.) a été surveillée comme la libération de HSCoA dépendant de Pi à partir d’acétyl-CoA avec DTNB . Le mélange d’essai contenait 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acétyl-CoA, 5 mM KH2PO4 et extrait.

3 Résultats

Pour étudier la fonction physiologique et la régulation des enzymes liées au métabolisme de l’acétate et de l’acétyl-CoA, des cellules de H. marismortui préalablement cultivées sur différents substrats ont été déplacées vers un milieu contenant de l’acétate et/ou du glucose et des peptides, respectivement, et les profils d’activité de l’ACD, de l’ACS, de la GDH et de la MS ont été analysés.

3.1 Croissance des cellules adaptées à l’acétate sur le glucose

Après une phase de latence, les cellules ont connu une croissance exponentielle et le glucose a été complètement consommé. Parallèlement à la consommation de glucose, des quantités significatives d’acétate ont été formées. Au cours de cette période, les activités de la GDH et de l’ACD ont augmenté, tandis que les activités de l’ACS et de la MS, qui étaient actives dans les cellules adaptées à l’acétate, ont été complètement déréglées. Dans la phase stationnaire, l’acétate excrété a été complètement reconstitué et les activités de l’ACS et du MS ont augmenté, tandis que les activités de la GDH et de l’ACD ont diminué (Fig. 1).

3.2 Croissance des cellules adaptées au glucose sur acétate

Les cellules adaptées au glucose ont grandi sur un milieu contenant de l’acétate initialement (environ 30 h) avec un temps de doublement de 10 h jusqu’à une densité optique (ΔOD578) de 1. Dans cette phase de croissance, aucune consommation d’acétate n’a été observée et les cellules ont grandi sur les peptides présents dans le milieu. Après cette période, les cellules se sont développées avec un taux de croissance réduit jusqu’à une ΔOD578 de 1,8 et l’acétate a été complètement consommé. Pendant la consommation d’acétate, les activités ACD et GDH ont diminué, tandis que les activités ACS et MS, qui n’ont pas pu être détectées dans les cellules adaptées au glucose, ont augmenté. L’augmentation de l’activité MS a commencé pendant la croissance sur les peptides, tandis que l’augmentation de l’activité ACS était parallèle à la consommation d’acétate (Fig. 2).

3.3 Croissance sur des mélanges glucose/acétate

Des cellules de H. marismortui adaptées à l’extrait de levure et aux casaminoacides ont été transférées dans un milieu contenant à la fois du glucose et de l’acétate. Les cellules ont montré une croissance diauxique avec une utilisation séquentielle du premier glucose et du second acétate. Dans la première phase de croissance, les cellules ont grandi jusqu’à un ΔOD578 de 4,0 et le glucose a été consommé. Après la consommation de glucose et une courte phase de latence, les cellules sont entrées dans la deuxième phase de croissance, dans laquelle l’acétate a été métabolisé et les cellules ont grandi jusqu’à un ΔOD578 final de 5,2. Dans la première phase de croissance, parallèlement à la consommation de glucose, les activités de l’ACD et de la GDH ont augmenté, tandis que l’activité de l’ACS n’a pas pu être détectée et que l’activité de la MS a été complètement déréglée. Dans la seconde phase de croissance parallèle à l’utilisation de l’acétate, les activités ACS et MS ont augmenté et les activités ACD et GDH ont diminué (Fig. 3).

3.4 Cellules adaptées au glucose sur peptides

Des cellules adaptées au glucose ont été déplacées sur un milieu contenant 0,25% d’extrait de levure et 0,5% de casaminoacides en absence de glucose et d’acétate. Les cellules se sont développées avec un temps de doublement de 13 h jusqu’à un ΔOD578 de 2,5. La formation d’acétate n’a pas pu être détectée. Pendant la croissance exponentielle, l’ACD (de 60 à 20 mU/mg) et la GDH (de 80 à 40 mU/mg) ont diminué, et l’activité de la MS, qui ne pouvait initialement pas être détectée, a augmenté jusqu’à 20 mU/mg. L’activité ACS n’a pas pu être détectée pendant la phase de croissance exponentielle, mais a augmenté pendant la phase stationnaire (13 mU/mg).

4 Discussion

Dans cet article, nous avons analysé le rôle physiologique des enzymes de conversion de l’acétate et de l’acétyl-CoA (ACD, ACS) chez H. marismortui et nous donnons les premières preuves de la régulation spécifique du substrat de ces enzymes ainsi que de la GDH et de la MS. Les données sont discutées en comparaison avec des systèmes bactériens connus.

4.1 La formation d’acétate chez H. marismortui est catalysée par l’ACD dans le cadre du métabolisme de « débordement »

Pendant la croissance sur le glucose et sur les mélanges glucose/acétate, les activités de l’ACD et de la GDH ont augmenté parallèlement aux phases de consommation de glucose et de formation d’acétate (figures 1 et 3). Inversement, les deux activités ont diminué pendant la croissance sur acétate ou sur peptides. Ces données et l’absence d’AK/PTA indiquent que la formation d’acétate dans Haloarcula est catalysée par l’ACD. Le rôle physiologique de la formation d’acétate dans H. marismortui et sa régulation pendant la croissance aérobie sur le glucose n’est pas compris ; la formation d’acétate pourrait faire partie d’un métabolisme de « débordement », qui a été étudié en détail dans diverses bactéries, par exemple Escherichia coli et Bacillus subtilis. Comme dans H. marismortui, les deux bactéries excrètent l’acétate pendant la croissance aérobie sur l’excès de glucose et le réutilise dans la phase stationnaire. On a supposé que l’excrétion d’acétate se produit dans des conditions où le taux de glycolyse dépasse celui des voies ultérieures, par exemple le cycle de l’acide citrique et la respiration nécessaire à l’oxydation complète du glucose. Dans ces conditions, l’acétyl-CoA est converti en acétate et excrété. Conformément à ce point de vue, les analyses transcriptionnelles réalisées avec E. coli et B. subtilis indiquent une induction des gènes glycolytiques spécifique du glucose et une répression des gènes du cycle de l’acide citrique et de la respiration. Une régulation transcriptionnelle similaire spécifique au glucose, c’est-à-dire une régulation positive des gènes glycolytiques de la voie Entner-Doudoroff modifiée, et une régulation négative de certains gènes du cycle de l’acide citrique et de la respiration, a récemment été signalée pour l’archaeon halophile H. volcanii. Ainsi, dans les haloarchaea un métabolisme de débordement spécifique au glucose résultant en la formation d’acétate est probable. La formation d’acétate chez E. coli et B. subtilis implique le mécanisme bactérien à deux enzymes via PTA et AK, alors que chez Haloarcula la formation d’acétate est catalysée par ACD, le mécanisme archéen à une seule enzyme. Chez E. coli et B. subtilis, on a constaté que le glucose induisait les gènes codant pour la PTA et l’AK, ce qui indique une régulation coordonnée de la glycolyse et de la formation d’acétate. Jusqu’ici, la régulation transcriptionnelle de l’ACD formant l’acétate dans l’archaeon H. marismortui n’a pas été analysée. Cependant, la régulation coordonnée de l’activité de la GDH et de l’ACD suggère une régulation transcriptionnelle similaire, spécifique au glucose, à la fois de la glycolyse par la voie modifiée d’Entner-Doudoroff et de la formation d’acétate par l’ACD.

Pendant la croissance aérobie sur des peptides, H. marismortui n’a pas formé d’acétate et l’activité de l’ACD a été régulée à la baisse. A cet égard, Haloarcula diffère de la bactérie E. coli, qui forme des quantités significatives d’acétate pendant la croissance aérobie sur des peptides au cours d’un métabolisme de « débordement ». H. marismortui diffère également de l’archée hyperthermophile anaérobie P. furiosus et d’autres archées hyperthermophiles anaérobies, qui forment de grandes quantités d’acétate au moyen de l’ACD pendant la croissance anaérobie sur des sucres et des peptides. Au cours de la fermentation anaérobie des peptides et des sucres de P. furiosus, la formation d’acétate par l’ACD représente le principal site de formation d’ATP via la phosphorylation au niveau du substrat ; en revanche, au cours de la dégradation aérobie des sucres et des peptides par H. marismortui, la majeure partie de l’énergie est conservée par la phosphorylation du transport des électrons dans la chaîne respiratoire et la formation d’acétate par l’ACD est donc moins importante ou inutile. Ainsi, la formation d’acétate par l’ACD chez Haloarcula semble être limitée au métabolisme des sucres au cours d’un métabolisme de « débordement ».

4.2 L’activation de l’acétate en acétyl-CoA chez H. marismortui est catalysée par l’ACS

Ceci a été conclu de la régulation à la hausse de l’activité de l’ACS parallèlement à la consommation d’acétate (Figs. 1, 2, 3). Un rôle de l’ACD dans l’activation de l’acétate a pu être exclu puisque l’ACD était régulé à la baisse pendant les périodes de consommation d’acétate. Ainsi, l’ACD dans Haloarcula fonctionne in vivo uniquement dans le sens de la formation d’acétate. L’ACS est également le mécanisme le plus courant d’activation de l’acétate chez les bactéries où il est strictement régulé ; par exemple, chez E. coli et B. subtilis, le gène acs est induit par l’acétate et réprimé par le glucose . Chez Haloarcula, l’augmentation de l’activité de l’ACS par l’acétate et sa diminution par le glucose suggèrent une régulation similaire au niveau transcriptionnel comme cela a été rapporté pour les bactéries. Il faut noter que contrairement à E. coli et B. subtilis, la bactérie C. glutamicum active l’acétate par une voie AK/PTA induite par l’acétate .

L’activité de MS, une enzyme clé du cycle du glyoxylate, a été régulée à la hausse pendant les périodes de consommation d’acétate chez H. marismortui en même temps que l’ACS, suggérant une régulation coordonnée spécifique à l’acétate de l’ACS et du cycle anaplérotique du glyoxylate. L’activité de la MS et de l’ACS a été régulée par le glucose. L’induction coordonnée spécifique à l’acétate des gènes des enzymes de l’activation de l’acétate (voir ci-dessus) et de la voie du glyoxylate a été rapportée pour plusieurs bactéries, y compris E. coli et C. glutamicum. Récemment, les premières preuves de l’induction des gènes de la malate synthase et de l’isocitrate lyase par l’acétate ont été données pour l’archée halophile H. volcanii.

Toutefois, l’activité de la MS plutôt que celle de l’ACS a également été régulée à la hausse pendant la croissance exponentielle sur les peptides en l’absence d’acétate, ce qui indique que la régulation de la MS est plus complexe et ne se limite pas à l’acétate. Un rôle du MS (et du cycle du glyoxylate) dans le métabolisme des peptides pourrait être expliqué par le fait que de nombreux acides aminés sont dégradés en acétyl-CoA, ce qui nécessiterait une voie du glyoxylate fonctionnelle pour l’anabolisme. L’augmentation de l’activité de l’ACS, observée en phase stationnaire pendant la croissance sur les peptides, ne peut pas être expliquée jusqu’à présent, elle pourrait être due à une réponse générale au stress des cellules en phase stationnaire .

4.3 Répression catabolite spécifique au glucose chez H. marismortui

Haloarcula marismortui a montré une croissance diauxique sur des mélanges de glucose/acétate avec le glucose comme substrat préféré indiquant une sorte de répression catabolique de l’utilisation de l’acétate par le glucose. La répression catabolique spécifique du glucose n’a pas été analysée chez les archées jusqu’à présent. Chez les bactéries, la base moléculaire de la répression catabolique du carbone par le glucose a été étudiée en détail, par exemple chez E. coli et B. subtilis. Pendant la croissance de C. glutamicum sur des mélanges glucose/acétate, une croissance monophasique a été décrite avec une consommation simultanée d’acétate et de glucose, alors que chez Azotobacter vinelandii, l’acétate est le substrat préféré. Les principes de régulation à l’origine de ces caractéristiques sont actuellement étudiés.

Des études supplémentaires sont nécessaires pour étayer la régulation spécifique au substrat proposée des enzymes de formation de l’acétate et d’activation de l’acétate, ACD et ACS, en relation avec le métabolisme de l’acétate et du glucose au niveau transcriptionnel. Ces études, qui nécessitent la purification et l’identification des gènes codants de l’ACD et de l’ACS de H. marismortui sont en cours.

Notes de l’auteur

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