Principes d’assemblage appris des études in vitro
Des sous-unités ribosomales 30S et 50S bactériennes fonctionnelles peuvent être reconstituées in vitro à partir d’ARNr plus chacune des protéines ribosomales. Des études détaillées des principes biochimiques et biophysiques qui sous-tendent l’assemblage des ribosomes in vitro ont fourni des paradigmes utiles pour guider les enquêtes sur la biogenèse des ribosomes in vivo.
Un des premiers principes révélés par ces expériences est que l’assemblage des r-protéines en sous-unités ribosomales se produit de manière hiérarchique. Les études de reconstitution des sous-unités ribosomiques 30S bactériennes ont défini une » carte d’assemblage » pour l’ordre d’association de chaque r-protéine avec l’ARNr. En fonction de leur ordre dans la hiérarchie de liaison, les r-protéines sont désignées comme primaires (se liant directement à l’ARNr), secondaires (la liaison dépend des protéines de liaison primaires), ou tertiaires (la liaison dépend des protéines de liaison secondaires). Bien qu’une telle carte de dépendance se soit avérée être un point de départ très utile, elle ne fournit aucune information sur la cinétique de la liaison des protéines. Au contraire, la voie d’assemblage peut largement refléter l’ordre dans lequel chaque protéine r est associée de manière plus stable à l’ARNr. De plus, la carte d’assemblage ne tient pas compte de la voie de repliement de l’ARNr 16S indépendante des r-protéines ou du rôle dans l’assemblage du ribosome du traitement nucléolytique des précurseurs de l’ARNr qui se produit in vivo. Plus récemment, ces aspects de l’assemblage de la sous-unité 30S ont été explorés plus en détail à l’aide de techniques telles que le sondage chimique et par radicaux hydroxyles de la conformation de l’ARN pour évaluer les changements de conformation de la rRNP en fonction du temps, et la spectrométrie de masse par impulsions (PC/MS) pour déterminer la cinétique de la liaison des r-protéines à l’ARNr.
Une explication possible de l’observation des r-protéines de liaison primaire dans la carte d’assemblage est que leurs sites de liaison sont créés au moins en partie par la conformation adoptée par l’ARNr 16S indépendamment des r-protéines. En fait, conformément à cette idée et à l’opinion selon laquelle les ribosomes ont évolué à partir d’un catalyseur ARN, il a été démontré que le domaine 5′ de l’ARNr 16S peut se plier et former des contacts tertiaires en l’absence de toutes les r-protéines. Cette structure tertiaire n’est vraisemblablement pas complètement stable en l’absence de contacts protéiques et, par conséquent, elle est très probablement stabilisée par la liaison des r-protéines à des sites qui sont créés par des conformations transitoires adoptées par l’ARNr lorsqu’il se replie. Par conséquent, le deuxième principe suggère que le repliement de l’ARNr fournit la base de la liaison des r-protéines pendant l’assemblage du ribosome.
Un troisième principe qui a émergé des études in vitro des ribosomes bactériens est que le renforcement de la liaison des r-protéines avec l’ARNr se produit à mesure que l’assemblage du ribosome progresse. De nombreuses r-protéines entrent en contact avec plusieurs nucléotides sur l’ARNr. L’empreinte des radicaux hydroxyles résolue dans le temps a révélé que certains de ces nucléotides sont protégés avant d’autres, ce qui suggère qu’au fur et à mesure que la biogenèse des ribosomes progresse, les r-protéines établissent davantage de contacts avec l’ARNr, devenant ainsi intégrées de manière plus stable aux ribosomes.
L’établissement initial de quelques contacts entre les r-protéines et l’ARNr stabilise potentiellement certaines conformations de l’ARN, et induit des changements dans la conformation de l’ARNr pour fournir des sites de liaison pour des r-protéines supplémentaires (secondaires ou tertiaires). Par conséquent, la liaison des r-protéines consolide les gains de repliement de l’ARN et confère une directionnalité au processus d’assemblage. Ceci suggère un modèle où l’assemblage se déroule par une série alternée de changements de conformation de l’ARN et de liaison de protéines, qui stabilisent séquentiellement la structure finale de l’ARN. Les données cinétiques ont révélé que l’assemblage des sous-unités 30S matures se fait par des voies multiples et parallèles de repliement de l’ARN, qui convergent toutes vers le produit final. Cela a conduit au concept d’un paysage d’assemblage par opposition à une voie unique sur laquelle l’assemblage des sous-unités ribosomiques se produit.
Enfin, des études in vitro ont révélé que l’assemblage des ribosomes se produit dans la direction 5′ vers 3′. Le PC/MS et le sondage chimique de la structure secondaire de l’ARNr ont montré que la liaison de la protéine r au domaine 5′ de l’ARNr peut être observée avant que les contacts de la protéine ne soient établis avec le domaine 3′ de l’ARNr. En revanche, les essais d’empreinte des radicaux hydroxyles ont montré une salve initiale de protection des nucléotides tout au long de l’ARNr 16S, ce qui indique que le repliement de l’ARN se fait à partir de nombreux sites différents répartis sur l’ARN, et indique donc un manque de directionnalité 5′ vers 3′ dans l’assemblage. Ces observations contradictoires peuvent être réconciliées en tenant compte de la nature des différents montages expérimentaux. Le PC/MS mesure la cinétique de la liaison des protéines à l’ARNr et, en tant que tel, seules les interactions stables entre les protéines et l’ARNr peuvent être détectées car les protéines qui se lient faiblement pendant l’impulsion peuvent être éliminées pendant la poursuite. Les tests d’empreinte, en revanche, peuvent capturer la protection des nucléotides par des r-protéines qui interagissent faiblement ou qui sont associées de manière stable. Prises ensemble, ces données indiquent que si l’assemblage du ribosome peut se nucléer sur l’ensemble de l’ARNr, l’association serrée finale des r-protéines avec l’ARNr se produit dans une direction 5′ vers 3′.
Il est important de considérer comment ces expériences in vitro pourraient ou non refléter l’assemblage in vivo. Par exemple, quand l’assemblage du ribosome se produit in vivo, il est couplé avec la transcription de l’ARNr, qui contribue aussi vraisemblablement à la directionnalité 5′ à 3′ observée de l’association de la protéine-r. L’ARNr peut avoir évolué pour se plier 5′ à 3′ pendant qu’il est synthétisé, et pour incorporer les protéines-r de cette façon, couplant ainsi l’assemblage avec la transcription de l’ARNr. En outre, la nécessité d’une étape de chauffage pendant la reconstitution des sous-unités ribosomiques in vitro et l’identification d’un certain nombre de mutants bactériens qui sont défectueux dans la production de ribosomes indiquent la nécessité de facteurs trans-actifs pendant la biogenèse des ribosomes in vivo.