Structure de l’acide α-glucosidase lysosomale humaine-un guide pour le traitement de la maladie de Pompe

Synthèse structurale

L’AGA est synthétisée sous la forme d’une glycoprotéine de 110 kDa, qui est ciblée vers le lysosome via le récepteur du mannose-6-phosphate et subit dans le compartiment endosomal/lysosomal tardif une série d’événements protéolytiques et de transformation du N-glycane pour donner une forme active mature composée de quatre peptides étroitement associés19,20. Étant donné que la cristallisation de la forme précurseur commerciale Myozyme® de la rhGAA (Q57-C952) n’a pas permis d’obtenir des cristaux diffractant au-delà de ~7 Å et que les prédicteurs de désordre des protéines21 indiquaient la présence de régions peptidiques désordonnées, nous avons effectué une protéolyse in situ avec de l’α-chymotrypsine pour éliminer les boucles de surface flexibles putatives empêchant la formation de contacts cristallins productifs. Le traitement protéolytique a donné un polypeptide d’une masse inférieure d’environ 5 kDa à celle du précurseur rhGAA (Fig. 2a), qui s’est cristallisé facilement. Cela nous a permis de recueillir les données de diffraction s’étendant jusqu’à 1,9 Å et de résoudre la structure de la rhGAA par remplacement moléculaire (tableau 1). La forme digérée par protéolyse avait une activité comparable à celle du précurseur (2,34 ± 0,06 et 2,26 ± 0,16 U mg-1 pour le précurseur et les formes matures, respectivement), ce qui indique que le traitement à l’α-chymotrypsine n’a pas modifié la fonctionnalité de la rhGAA.

La structure cristalline de la rhGAA correspond à la forme mature de la GAA placentaire humaine et de la rhGAA20 (Fig. 2b), suggérant que le traitement avec l’α-chymotrypsine a permis l’élimination des régions labiles aux protéases (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 et A782-R794) d’une manière comparable à la maturation protéolytique se produisant in vivo. L’architecture globale de la rhGAA est similaire à celle des homologues humains de la famille des glycoside hydrolases GH311, les enzymes intestinales de la bordure en brosse, la maltase-glucoamylase (MGAM)22,23 et la sucrase-isomaltase (SI)24 (figure 2c et figure supplémentaire 1). Un domaine tréflé de type P N-terminal est suivi d’un domaine β-feuilleté, le barillet catalytique (β/α)8 portant deux inserts après les brins β3 (insert I) et β4 (insert II), et des domaines β-feuilleté proximaux et distaux à l’extrémité C-terminale. La forme précurseur de rhGAA contient ~14 kDa de glucides et sept sites de glycosylation ont été prédits et caractérisés20. Nous avons observé des structures de glycanes de différentes longueurs pour cinq d’entre eux dans la structure cristalline, notamment à N140, N233, N390, N470 et N652 (Fig. 2c et Fig. 2 supplémentaire). Nous avons détecté une densité électronique différentielle résiduelle à N882, insuffisante pour modéliser une structure de glycanes, et n’avons pas observé de densité électronique différentielle près de N925.

Site actif et liaison des inhibiteurs

L’étroite poche de liaison au substrat de la rhGAA est située près des extrémités C-terminales des brins β du domaine (β/α)8 catalytique et formée par une boucle du domaine β-feuilleté N-terminal et des deux inserts I et II (Fig. 2c). Les enzymes de la famille GH31 effectuent la catalyse via un mécanisme de réaction classique à double déplacement de Koshland avec rétention de la configuration anomérique du carbone dans le produit. À partir de la caractérisation précoce du site catalytique de la GAA25 et par homologie avec les membres de la famille GH3126,27 disséqués mécaniquement, le nucléophile et l’acide/base catalytiques peuvent être assignés à D518 et D616, respectivement. Pour mieux comprendre l’interaction de la rhGAA avec le chaperon pharmacologique documenté 1-deoxynojirimycin16,28 et son dérivé N-hydroxyethyl-deoxynojirimycin29 (DNJ et NHE-DNJ, respectivement), nous avons immergé des cristaux de rhGAA avec ces inhibiteurs iminosugar dirigés vers le site actif et nous avons obtenu pour les deux complexes des données de diffraction s’étendant jusqu’à une résolution de 2,0 Å (tableau 1). La DNJ se lie dans une conformation 4C1 dans le sous-site -130 de liaison au substrat et est stabilisée par des liaisons hydrogène avec les chaînes latérales de D404, D518, R600, D616 et H674. D’autres interactions stabilisantes sont fournies par des contacts hydrophobes avec W376, I441, W516, M519, W613, et F649 (Fig. 3a, b). En dehors d’une inclinaison de 20° de la chaîne latérale de W376, aucun changement conformationnel majeur ne se produit lors de la liaison de la DNJ dans le site actif de la rhGAA. Ce n’est pas le cas pour la liaison de NHE-DNJ, qui adopte la même pose que la DNJ, mais où le substituant hydroxyéthyle induit des changements conformationnels substantiels aux chaînes latérales de M519 et W481 (Fig. 3c, d). Dans cette conformation induite par le ligand, le résidu W481 de la rhGAA, situé à l’extrémité de l’insert I, établit une interaction stabilisatrice avec le substituant hydroxyéthyle de la NHE-DNJ. Des changements conformationnels similaires peuvent être observés lors de la liaison de NHE-DNJ à la sous-unité N-terminale de la MGAM (NtMGAM)31 (figure supplémentaire 3a).

Reconnaissance du substrat et spécificité

Pour recueillir une perception de la reconnaissance du substrat par la rhGAA, nous avons acquis les données de diffraction s’étendant à une résolution de 2,45 Å pour un cristal de rhGAA imbibé d’acarbose, un analogue de substrat α-1,4-tétrasaccharide non clivable (tableau 1). Dans ce complexe, l’anneau de valiénamine logé dans le sous-site -1 adopte une conformation à demi-chair 2H3, mais malgré cette différence de conformation par rapport à la DNJ liée dans la conformation à demi-chair 4C1, le schéma de liaison hydrogène dans le sous-site -1 est essentiellement identique pour les deux composés (Fig. 3e, f et Fig. 3b supplémentaire). L’azote « interglycosidique » non hydrolysable occupe le centre catalytique et est lié par hydrogène à l’acide/base catalytique D616. La fraction 6-désoxyglucosyle dans le sous-site + 1 établit via ses groupes 2- et 3-hydroxyle des liaisons hydrogène avec le R600 conservé et avec D282 provenant d’une boucle dans le domaine β-sheet N-terminal. Bien que non conservés dans la séquence, les résidus de cette boucle interagissent invariablement avec les ligands glucidiques dans toutes les structures cristallines disponibles des membres de la famille GH31. L’unité de maltose de l’acarbose dans les sous-sites + 2 et + 3 n’a pas d’interactions directes avec la rhGAA et est plutôt stabilisée par les interactions du réseau cristallin et un contact médié par l’eau avec la chaîne latérale de W618, située au bord de la poche de liaison du substrat. Cette rareté des interactions suggère que la rhGAA ne possède que deux sites productifs de liaison au substrat, les sous-sites -1 et + 1, mais il est intéressant de noter que la fraction acarbose-maltose liée à la rhGAA adopte la même pose globale que lorsqu’elle est liée à la NtMGAM22, ce qui suggère un rôle fonctionnel également pour les sous-sites + 2 et + 3 dans la rhGAA (figure supplémentaire. 3c).

Le glycogène est un grand polymère constitué par des chaînes linéaires de résidus de glucose liés à l’α-1,4 portant des branches liées à l’α-1,6. Dans le cytosol, la particule de stockage d’énergie est dégradée par l’action concomitante de la glycogène phosphorylase et d’une enzyme de débranchement. Au sein du lysosome, aucune enzyme de débranchement n’est présente et la GAA doit assurer l’hydrolyse des deux liaisons α-1,4- et α-1,6-glycosidiques. Cependant, la rhGAA montre une nette préférence pour la première liaison, car la constante de spécificité sur le maltose est 32 fois plus élevée par rapport à la constante de spécificité sur l’isomaltose (Tableau supplémentaire 2). Pour découvrir la base structurelle de la double spécificité du substrat, nous avons essayé de tremper les cristaux de rhGAA avec le tétrasaccharide non hydrolysable glucopyranosyl-α-(1,6)-thio-maltotriose. Cependant, cette approche a échoué, très probablement en raison des contacts cristallins qui empêchent l’accommodation du tétrasaccharide, qui, en vertu de la liaison α-1,6, est légèrement plus long que l’acarbose. On a observé que ce dernier s’insère à peine dans la fente de liaison du substrat et qu’il est étroitement contigu à une molécule symétriquement apparentée (Fig. 3e). Nous avons dérivé un disaccharide à liaison α-1,6 lié à l’intérieur du site actif de la rhGAA par une superposition structurelle de la rhGAA avec le domaine (β/α)8 catalytique de la GAA de Blautia obeum en complexe avec l’isomaltose32 (rmsd de 1,50 Å pour 318 positions Cα alignées). Le modèle révèle qu’aucun encombrement stérique ne se produit par l’accommodation d’une liaison α-1,6 entre les sous-sites -1 et + 1 et que les liaisons hydrogène productives entre la partie glycopyranose dans le sous-site + 1 et D282 sont maintenues (Fig. 4a, b). Cependant, en raison de la longueur accrue de la liaison α-1,6 par rapport à une liaison α-1,4, la liaison hydrogène stabilisante avec R600 est affaiblie, ce qui pourrait expliquer une activité plus faible de l’enzyme sur les branches liées à l’α-1,6.

Le domaine secondaire de liaison au substrat

Dans le complexe rhGAA-acarbose, nous avons pu observer la fraction acarvosine d’une seconde molécule d’acarbose logée dans une poche à l’intérieur du domaine Type-P tréflé N-terminal, situé sur la même face de la rhGAA où se trouve le site actif et à 25 Å de l’acarbose qui y est lié (Fig. 4c). La partie valiénamine se lie par hydrogène avec ses groupes 4- et 6-hydroxyle à l’azote et à l’oxygène de la chaîne principale de C127, à l’oxygène de la chaîne principale de A93 et à la chaîne latérale de D91. D’autres interactions stabilisantes sont fournies par des interactions d’empilement avec P125 et W126. P125 et D91 sont conservés ou remplacés par des substitutions conservatrices dans les enzymes de la famille GH31 comprenant un domaine de type P en trèfle (figure supplémentaire 4a). Adjacente au site secondaire de liaison aux glucides, la boucle de surface G116-M122 a été coupée par traitement protéolytique. Il est concevable que l’élimination du segment G116-M122, unique aux représentants lysosomaux de la famille GH31 (figures supplémentaires 4a, b), puisse contribuer à la formation de la poche secondaire de liaison au substrat. On pourrait envisager que le site secondaire de liaison à l’acarbose sur la rhGAA représente un véritable site de liaison au substrat, susceptible d’améliorer la processivité de l’enzyme. Ce site pourrait également représenter un pharmacophore pour le criblage in silico de nouveaux chaperons pharmacologiques. Plus particulièrement, un trisaccharide dérivé de l’acarbose est lié au domaine N-terminal de la famille GH31 α-1,4-glucan lyase de Gracilariopsis lemaneiformis 33 dans une position proche du site secondaire de liaison au substrat décrit ici (figure supplémentaire 5).

La N-acétylcystéine est une chaperonne pharmacologique allostérique

Le médicament pharmaceutique connu N-acétylcystéine (NAC) a été montré pour agir comme chaperonne pharmacologique allostérique améliorant la stabilité de la GAA endogène mutée et de la rhGAA utilisée pour l’ERT, sans affecter l’activité catalytique18. Afin d’exploiter le potentiel thérapeutique de la NAC pour la maladie de Pompe via des études structurelles, nous avons recherché la structure cristalline de la rhGAA en complexe avec la NAC. La structure du complexe, d’une résolution de 1,83 Å, obtenue par des expériences de trempage des cristaux (Tableau 1), révèle deux sites de liaison à la NAC éloignés du site actif (Fig. 4d, e), ce qui fournit des preuves structurelles que la NAC est effectivement un chaperon allostérique, comme le prévoient les études fonctionnelles18. Nous avons vérifié par des essais d’activité et par la fluorimétrie à balayage différentiel que la NAC stabilise aussi bien la rhGAA que l’enzyme mûrie par protéolyse produite dans cette étude, et que la chaperonne est spécifique à la GAA, puisque la NAC n’a aucun effet stabilisateur sur un homologue de la GH31 du riz (Fig. 6a, b et Tableaux supplémentaires 3 et 4). Dans la structure du complexe rhGAA-NAC, une molécule de NAC, appelée NAC1, est située à environ 30 Å du site actif, à l’interface entre le barillet (β/α)8 et le domaine β-feuilleté distal (Fig. 4d). NAC1 se lie au carboxyle de la chaîne principale de H432 via son azote d’amide et la fonction carboxyle établit un contact médié par l’eau avec la chaîne latérale de D513. Les groupes Cβ-Sγ et acétyle établissent des interactions par empilement avec le groupe guanidine de R437 et la boucle G434-G435, respectivement. Une deuxième molécule de NAC (NAC2), partiellement (75%) occupée, est logée à l’interface entre le barillet (β/α)8 et le domaine β-sheet proximal à une distance de 25 Å du site actif (Fig. 4e). La fonction carboxyle de NAC2 établit un contact médié par l’eau avec l’oxygène de la chaîne principale de L756, le thiol s’empile contre la chaîne latérale de Q757 et le groupe acétyle s’empile contre la chaîne latérale de H742. Les deux molécules de NAC établissent des interactions moins nombreuses et plus faibles avec la rhGAA que les chaperons DNJ et NHE-DNJ. Cela reflète les concentrations plus élevées de NAC nécessaires pour l’activité de chaperon (mM vs, µM) comme l’illustre le K D de 11,57±0,74 mM que nous avons obtenu par fluorimétrie à balayage différentiel et par le K i de 3,4 et 3,0 µM pour la DNJ et la NHE-DNJ, respectivement18,29. Une courbe de saturation sigmoïdale s’ajustant au mieux aux points expérimentaux soutient les sites de liaison allostériques de la NAC entièrement (NAC1) et partiellement (NAC2) occupés (figure supplémentaire 6c). Les interactions d’empilement établies entre les groupes acétyles de NAC1 et NAC2 et le rhGAA doivent contribuer de manière significative à l’énergie de liaison, puisque les acides aminés apparentés à la NAC, tels que la N-acétylsérine et la N-acétylglycine ont également un effet stabilisant sur le rhGAA, tandis que les homologues non acétylés n’ont aucun effet18. La structure du complexe rhGAA-NAC montre une diminution des paramètres de déplacement thermique atomique des résidus entourant les sites de liaison à la NAC par rapport à celle de la rhGAA non liée, ce qui indique une fonction stabilisatrice inter-domaines globale dirigée par la NAC (Fig. 7a-d supplémentaires). Dans le cristal, la NAC semble également exercer un effet anti-oxydant, car le résidu C938 est oxydé en forme d’acide sulfénique dans toutes les structures cristallines décrites ici, à l’exception de la structure du complexe rhGAA-NAC (figures supplémentaires 8a, b).

La NAC et les iminosucres présentent des profils de chaperonnage différents

Certaines mutations conduisant à la maladie de Pompe répondent à la fois à la NAC et aux iminosucres DNJ et NB-DNJ, tandis que d’autres sont ciblées spécifiquement par l’un ou l’autre chaperon pharmacologique16,17,18. La grande majorité des mutants du GAA répondant à l’activité chaperonne des iminosucres sont situés soit à portée du site actif, soit sur des éléments structuraux contribuant à son architecture globale. Chez le patient de Pompe, les fibroblastes et les modèles de souris, les mutants GAA les plus réactifs à la NAC (A445P, Y455F et L552P)18 sont situés sur les inserts I et II, où les résidus de type sauvage correspondants contribuent à la stabilisation du domaine. A445 et F487 définissent ensemble les limites de l’insert I, et le mutant A445P déstabilise très probablement l’ensemble de l’échafaudage de l’insert I (figure supplémentaire 9a). L’hydroxyle de la chaîne latérale de Y455 sur l’insert I interagit avec une longue boucle du domaine catalytique, tandis que la chaîne latérale de L552 sur l’insert II établit des interactions hydrophobes avec des résidus du domaine β-feuilleté N-terminal (figures supplémentaires 9b, c). Les mutants respectifs Y455F et L552P ont très certainement un effet déstabilisant global, qui est clairement corrigé par la NAC. Par conséquent, l’action chaperonne des iminosucres peut être considérée comme un sauvetage conformationnel des sites actifs structurellement perturbés, tandis que l’effet de la chaperonne allostérique NAC semble être dû à la stabilisation des fluctuations conformationnelles globales ou locales.