Synthèse et activité inhibitrice de quelques dérivés de la 4-hydroxycoumarine sur la protéase du VIH-1

Abstract

Six nouveaux dérivés de la 4-hydroxycoumarine ont été synthétisés rationnellement, vérifiés et caractérisés par docking moléculaire en utilisant la protéase du VIH-1 cristallin. Les études de docking moléculaire ont prédit l’activité antiprotéase de (7) et (10). Les groupes fonctionnels les plus significatifs, responsables de l’interaction avec la protéase du VIH-1 par la formation de liaisons hydrogène sont l’oxygène du pyranne, l’atome, l’oxygène du carbonyle de la lactone et l’un des groupes hydroxyle. Les nouveaux composés synthétisés ont été testés biologiquement sur des cellules MT-4 pour inhiber la réplication du VIH-1, en explorant la protection des cellules contre l’effet cytopathique du VIH mesuré par la survie cellulaire dans le test MTT. Un dérivé -7 a montré une inhibition de 76-78% de l’infectivité du virus avec une IC50 = 0,01 nM, beaucoup moins que la concentration maximale non toxique (1 mM). L’activité antiprotéase de 7 à deux concentrations différentes a été détectée à 25%. Néanmoins, les résultats de l’étude de (7) encouragent à l’utiliser comme un pharmacophore pour la synthèse ultérieure et l’évaluation de l’activité anti-VIH.

1. Introduction

La protéase rétrovirale (PR) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’une des enzymes clés pour la réplication du virus. Elle clive les précurseurs protéiques et glycoprotéiques pour donner des enzymes virales actives et des protéines structurelles. La PR du VIH-1 inactive conduit à des virions non infectieux. Ce fait a stimulé la recherche de substances puissantes ayant une activité antiprotéase inhibant la réplication du VIH-1. Au cours des 12 dernières années, un certain nombre d’analogues peptidomimétiques – inhibiteurs de la PR du VIH-1 (IP) – ont été introduits en clinique, mais la plupart d’entre eux présentent des caractéristiques pharmacologiques médiocres telles qu’une mauvaise biodisponibilité orale, une clairance rapide et des problèmes de tolérance – souvent associés à la lypodystrophie et à la dyslipidémie. De plus, étant donné qu’il s’agit de peptidomimétiques, les isolats viraux démontrent rapidement un degré élevé de résistance et de résistance croisée, même en utilisant les membres du groupe avant que les IP ne soient mis sur le marché.

Le développement de nouveaux IP non peptidiques, tels que le Tipranavir et le Darunavir, a montré une puissance impressionnante contre les mutants résistants aux IP, restant ainsi une option importante pour les patients hébergeant une telle résistance . C’est la raison pour laquelle il faut rechercher de nouvelles substances non peptidiques inhibitrices de la protéase du VIH-1. Les données expérimentales sur certaines substances non peptidiques – les 4-hydroxycoumarines (figure 1) et les dérivés de 4-hydroxypyranne inhibant la PR du VIH-1, soutiennent cette idée .

Figure 1

Structure de la 4-hydroxycoumarine.

Etant depuis de longues années intéressés par la synthèse et l’évaluation d’une gamme de substances non peptidiques telles que les dérivés de la 4-hydroxycoumarine , nous avons été encouragés à étendre ces expériences. Ici, un certain nombre de nouvelles synthèses sont présentées, accompagnées d’expériences de docking moléculaire en utilisant l’enzyme cristalline et l’évaluation de l’activité biologique de nouveaux et prometteurs dérivés de 4-hydroxycoumarine.

2. résultats et discussion

2.1. Synthèse des dérivés de la 4-Hydroxycoumarine

2.1.1. Synthèse des arylméthylène-β-cétoesters

Des aldéhydes aromatiques différemment substitués sont utilisés pour la synthèse des arylméthylène-β-cétoesters via la réaction de Knoevenagel avec l’acétoacétate d’éthyle en présence de pipéridine comme agent basique et d’acide acétique glacial. Ces arylméthylène-β-cétoesters peuvent être présentés comme sur la figure 2.

Figure 2

Structure chimique générale et synthèse des arylméthylène-β-cétoesters.

Une réaction du 4-hydroxybenzaldéhyde et de la 2,4-pentanedione a également été réalisée dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus. Le produit isolé était la 3-(4-hydroxy)phénylméthylène-2,4-pentanedione (6) , voir figure 3.

Figure 3

Synthèse de la 3-(4-hydroxy)phénylméthylène-2,4-pentanedione (6).

2.1.2. L’addition de Michael des arylméthylène-β-cétoesters et des arylméthylène-2,4-pentanediones à la 4-hydroxycoumarine

La deuxième étape de la réaction est une addition des arylméthylène-β-cétoesters obtenus avec la 4-hydroxycoumarine par la réaction de Michael, en utilisant le méthoxyde de sodium ou la pipéridine comme agent basique . Cette réaction peut être exprimée comme dans la figure 4.

Figure 4

L’addition de Michael de la 4-hydroxycoumarine et des arylméthylène-β-cétoesters.

Figure 5

L’addition de Michael de la 4-hydroxycoumarine et de la 3-(4-hydroxy)phénylméthylène-2,4-pentanedione (6).

2.2. Docking moléculaire

L’interaction de la protéase du VIH-1 par docking moléculaire avec certains dérivés de 4-hydroxycoumarine nouvellement synthétisés a été étudiée. Des données expérimentales concernant l’activité de certaines 4-hydroxycoumarines ont été utilisées pour la comparaison.

Un docking moléculaire préliminaire a été réalisé sur la base des dérivés de 4-hydroxycoumarine connus, qui ont une activité inhibitrice de la protéase du VIH-1 (tableau 1) . La grille est choisie pour surdimensionner le ligand qui est précédemment lié à l’enzyme (dans ce cas, une taille de 7 Å de la grille a été choisie).

Les valeurs des fonctions 𝐺-score et E-model ont été obtenues par cette méthode. Elles sont appelées fonction de score et sont des équivalents abstraits de Δ𝐺bind. Ces fonctions prennent en compte l’énergie libre due aux effets du solvant, aux changements de conformation de la protéine et du ligand, aux interactions entre la protéine et le ligand (liaisons hydrogène, interaction ionique et forces de van der Waals), à la perte d’énergie libre de gel de rotation interne de la protéine et du ligand, à la perte d’énergie libre en translation et en rotation, causée par l’association des deux molécules, et à l’énergie libre due aux changements de mode vibratoire (généralement ignorée). Si ces valeurs sont plus négatives pour un ligand, cela signifie que la capacité de liaison de ce ligand est meilleure. Lorsque le ligand montre une capacité de liaison dans une conformation déterminée, le programme l’indique comme une « bonne pose ».

Cette enzyme est constituée de deux chaînes polypeptidiques et elle appartient à la famille des aspartyl-protéases avec deux résidus aspartate situés au fond du site actif. Nous avons utilisé la structure cristallographique de la protéase rétrovirale HIV-1, liée à un inhibiteur peptidomimétique BEA369 de la banque de données des protéines avec le code pdb 1EBY.

On peut conclure que le ligand (1) a la plus forte capacité de liaison à la protéase du VIH-1. Les résultats du docking moléculaire confirment les données expérimentales concernant le ligand (1).

Concernant les ligands (1)-(5), les valeurs du 𝐺-score et du modèle E issues du docking moléculaire, pour le groupe de composés testés, sont présentées dans le tableau 2.

Les interactions entre les dérivés de 4-hydroxycoumarine étudiés et les sites actifs de l’enzyme HIV-1 protéase sont réalisées par la liaison hydrogène et les interactions de van der Waals. Le composé le plus actif, par exemple, avec la meilleure activité de liaison, est le composé (10), selon les ligands (1)-(4) (sur la base des valeurs des fonctions de notation). Ce fait est probablement dû à la formation de liaisons hydrogène entre l’atome d’oxygène du pyranne, l’oxygène du carbonyle de la lactone, et l’un des groupes hydroxyle (dans la métaposition) attaché au cycle aromatique à partir de la chaîne latérale. Les forces d’attraction de van der Waals contribuent également à une bonne liaison. Selon le ligand (5), le composé (7) est le plus actif. Il existe deux liaisons hydrogène pour le composé (7) avec la participation de l’atome d’oxygène du pyranne, de l’atome d’oxygène du carbonyle du cycle lactone et d’un et des fragments de protéine correspondants. Les interactions d’attraction de van der Waals, dans lesquelles le groupe m-nitro participe probablement avec l’un de ses atomes d’oxygène, sont importantes pour la liaison. Le composé (7) semble être plus actif que les ligands expérimentaux.

2.3. Activité biologique en culture cellulaire (cellules MT-4)

Après avoir démontré l’activité de certains dérivés de 4-hydroxycoumarine envers le VIH-PR isolé dans des expériences de docking moléculaire, il serait intéressant de les tester davantage sur des cellules MT-4 infectées par le VIH-1. L’évaluation de l’effet anti-VIH a été effectuée par un test d’infection in vitro rapide et sensible en microtitrage basé sur la quantification de la cytolyse par absorption du colorant vital (MTT) comme point final de l’infection. En outre, l’effet des inhibiteurs sur l’activité de la transcriptase inverse (TI) endogène des surnageants de MT-4 infectés par le VIH-1 III B a été considéré comme un marqueur de la capacité à bloquer la réplication du VIH-1. Les cellules MT-4 ont été infectées et incubées avec chaque inhibiteur pendant 72-96 heures, puis l’activité RT a été mesurée dans les surnageants cellulaires conformément aux directives du test HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suède). Une étude de l’effet direct des 4-hydroxycoumarines nouvellement synthétisées sur la RT recombinante exogène (rRT) a également été réalisée. En outre, tous les composés ont été testés pour l’activité PR anti-HIV-1. Le tableau 3 représente les résultats du test d’infection en microtitre utilisant le MTT et l’inhibition de l’activité PR du VIH-1. Les expériences ont été réalisées à la concentration maximale non toxique (CMN) pour chaque composé.

Tout d’abord, on constate que les composés (8), (7) et (12) ont une CMN plus élevée, ce qui signifie qu’ils sont plus cytotoxiques que les trois autres composés. Seuls deux d’entre eux (10) et (7) ont inhibé la réplication virale dans les cellules MT-4, l’inhibition induite par (7) était remarquable (78%). En utilisant des dilutions virales 10x, la CI50 a été établie à 0,01 nM. Aucun composé n’a montré d’effet à la fois sur la RT endogène et exogène. Cela signifie que la RT n’était pas la cible de l’action antivirale. Comme prévu par les études de docking moléculaire, l’activité PR du VIH-1 a été inhibée de 24 à 25 % par (7) (5 évaluations distinctes ont été effectuées). La discordance trouvée pour (7) entre les données concernant l’inhibition de l’infectivité (environ 75 %) et l’activité protéasique (25 %) pourrait s’expliquer par une autre activité, comme celle de l’anti-intégrase. Il est bien connu que certains dérivés de la 4-hydroxycoumarine sont des inhibiteurs de l’intégrase.

Les expériences décrites dans cet article élargissent celles rapportées précédemment selon lesquelles les dérivés de la 4-hydroxycoumarine pourraient servir de nouveaux IP non peptidiques. Comme le tipranavir et le darunavir, ils pourraient être efficaces chez les patients ayant développé une résistance aux IP peptidiques. En particulier, (7) pourrait être utilisé comme un pharmacophore pour synthétiser de nouveaux dérivés plus actifs contre la protéase du VIH-1.

3. conclusion

Six composés de 4-hydroxycoumarine ont été synthétisés par une synthèse en deux étapes. La première étape est la réaction de Knoevenagel entre des aldéhydes aromatiques et l’acétoacétate d’éthyle ou l’acétylacétone. La deuxième étape est l’addition de Michael de l’arylméthylène-β-cétoester ou de l’arylméthylène-2,4-pentanedione obtenus avec la 4-hydroxycoumarine. Les produits sont identifiés et caractérisés par 1H NMR, EI-MS, FTIR et analyse des éléments.

L’étude de leur activité de liaison au VIH-1 PR a été réalisée par docking moléculaire. Le cristal HIV-1 PR, lié à l’inhibiteur peptidomimétique BEA369, a été utilisé. L’activité de liaison la plus élevée montre le composé (10), selon les ligands expérimentaux (1), (2), (3), et (4) et le composé (7), selon le ligand 5. Ce fait est probablement dû à la formation de liaisons hydrogène entre l’atome d’oxygène du pyranne, l’oxygène du carbonyle de la lactone et l’un des groupes hydroxyle (dans la métaposition) attaché au cycle aromatique à partir de la chaîne latérale. Les forces d’attraction de van der Waals contribuent également à une bonne liaison.

Les six composés ont été testés pour leur activité PR anti-VIH-1 sur des cellules MT4 infectées par le VIH-1. La survie des cellules a été évaluée par le test MTT et le % d’inhibition de la PR du VIH-1 a également été mesuré. La plus forte inhibition de la PR du VIH-1 (25%) et la plus forte survie des cellules MT4 (78%) ont été démontrées par le composé (7). Le composé (7) pourrait en outre être utilisé comme un pharmacophore pour synthétiser de nouveaux dérivés plus actifs vis-à-vis du VIH-1 PR.

4. Partie expérimentale

4.1. Synthèse des dérivés de la 4-Hydroxycoumarine

4.1.1. Matériaux et méthodes

Toutes les matières premières ont été achetées chez Merck, Sigma-Aldrich et Fluka. Ils sont utilisés sans purification supplémentaire. Les points de fusion sont mesurés dans des tubes capillaires ouverts sur un appareil à point de fusion Büchi 535. Les spectres IR ont été enregistrés au spectromètre Shimadzu FT-IR 8101 M en nujol, et les fréquences sont exprimées en cm-1. Les spectres de RMN 1H ont été enregistrés dans un Brucker 250 MHz dans du DMSO-d6 ou de l’acétone en utilisant le TMS comme standard interne (les déplacements chimiques sont rapportés en unités ppm, les constantes de couplage (𝐽) en Hz). Les abréviations sont les suivantes : s : singulet, d : doublet, dd : double doublet, dq : double quartet, dqui : double quintet, t : triplet, et m : multiplet.

L’analyse spectrale de masse a été réalisée par ionisation électronique sur le spectromètre de masse Hewlett-Packard 5973 à 70 eV.

4.1.2. Procédure générale de préparation des arylméthylène-β-cétoesters

L’aldéhyde aromatique et l’acétoacétate d’éthyle en quantités équimolaires sont mélangés dans un ballon à fond rond. La pipéridine (0,03 mol) et l’acide acétique glacial (0,04 mol) sont également ajoutés au mélange réactionnel. Ce dernier est agité à température ambiante pendant 90 minutes. Après avoir ajouté 20 mL d’éther et/ou 150 mL d’eau distillée au mélange réactionnel, des cristaux de couleurs différentes se forment. Ces cristaux sont filtrés et lavés. Ensuite, ils sont séchés à température ambiante et recristallisés dans des solvants appropriés – principalement des alcools (éthanol, propanol et 2-propanol) et de l’eau.

4.1.3. Procédé de préparation de la 3-(4-Hydroxy)-Phénylméthylène-2,4-Pentandione (6)

Le 4-Hydroxybenzaldéhyde (3,66 g, 0,03 mol) et l’acétylacétone (5,14 mL, 0,05 mol) sont mélangés dans un ballon à fond rond. La pipéridine (0,03 mol) et l’acide acétique glacial (0,04 mol) sont également ajoutés au mélange réactionnel. Ce dernier est agité à température ambiante pendant 120 minutes. Ensuite, 150 mL d’eau distillée sont ajoutés au mélange réactionnel. Des cristaux de différentes couleurs se forment. Ces cristaux sont filtrés et lavés. Puis ils sont séchés à température ambiante et recristallisés dans du chlorure de méthylène.

4.1.4. Procédure générale de préparation des produits de condensation avec la 4-Hydroxycoumarine

L’arylydène-β-cétoester, obtenu dans la réaction précédente, et la 4-hydroxycoumarine sont mélangés en quantités équimolaires dans 25-30 mL de méthanol (utilisé comme solvant). Du méthoxyde de sodium (0,003 mol) comme agent basique est également ajouté aux réactifs. Le mélange réactionnel est porté à ébullition et agité pendant 60 heures sous reflux. La réaction est contrôlée par CCM (hexane : acétone = 2 : 1 ou hexane : acétone : chloroforme : méthanol = 5 : 3 : 2 : 1). Lorsque les quantités de réactifs sont épuisées, le chauffage est arrêté. Le résidu du mélange réactionnel est filtré et lavé à l’eau chaude, afin d’éliminer la 4-hydroxicoumarine qui n’a pas réagi. Après cela, le résidu est séché à température ambiante et recristallisé dans un solvant approprié (méthanol, éthanol ou 2-propanol).

4.1.5. L’addition de Michael entre la 3-(4-Hydroxybenzylidène)-2,4-pentanedione (SS-23) et la 4-hydroxycoumarine

La 3-(4-Hydroxybenzylidène)-2,4-pentanedione (1,02 g, 0,005 mol) et la 4-hydroxycoumarine (0,81 g, 0,005 mol) sont mélangées en léger excès de 4-hydroxycoumarine dans 15-25 mL de méthanol. La pipéridine (0,003 mol) comme agent basique est également ajoutée aux réactifs. Le mélange réactionnel est porté à ébullition et agité pendant 60 heures sous reflux. La réaction est contrôlée par CCM (hexane : chloroforme : acide acétique = 10 : 10 : 4, hexane : chloroforme : acide acétique = 10 : 10 : 2, hexane : acétone = 2 : 1). Lorsque les quantités de réactifs sont épuisées, le chauffage a été arrêté. Le résidu du mélange réactionnel a été filtré et lavé avec de l’eau chaude, afin d’éliminer la 4-hydroxicoumarine qui n’a pas réagi. Après cela, le résidu est séché à température ambiante et recristallisé dans l’acétone.

4.2. Docking moléculaire

Tous les calculs de docking moléculaire sont effectués avec les programmes Maestro Macromodel Glide de Schrodinger package . Toutes les structures (testées expérimentalement et nouvelles) sont minimisées par le programme Macromodel, en utilisant le champ de force OPLS2005 et 5000 itérations. La structure aux rayons X de l’enzyme protéase du VIH-1, avec l’inhibiteur BEA369, est obtenue de la Banque de données des protéines avec le code PDB 1EBY.

4.3. Lignées cellulaires et virus

La lignée de cellules lymphoblastoïdes humaines en suspension MT-4-a, aimablement fournie par Gianfranco Pancino – Institut Pasteur, (Unité de Régulation des Infections Rétrovirales, Paris, France) représente un modèle classique pour l’infection productive expérimentale avec la souche III B du VIH-1 et est utilisée comme cible de routine pour l’étude de l’effet des inhibiteurs putatifs du VIH en culture cellulaire .

Comme source de VIH-1, des surnageants de la lignée H9/HTLV III B – un don du Dr R. Gallo (NIH, USA) – ont été utilisés. Les surnageants ont été recueillis et centrifugés pour éliminer les cellules, et des stocks de virus ont été préparés avec une teneur connue en antigène p24 (460 pg/mL, test Murex HIV Antigen mAB), une activité RT (565,3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Suède) et une infectivité (2 × 106 virions infectieux/mL, test d’infection en microtitration). Les cellules B MT-4 et H9/HTLV III ont été cultivées dans du RPMI 1640 complété par 10 % de FCS (invitrogen).

4.4. Tests de cytotoxicité et essais antiviraux en culture cellulaire

Les composés étudiés ont d’abord été dissous dans du DMSO, puis dilués dans un milieu de croissance cellulaire sans sérum fœtal. Toutes les solutions ont été préparées ex tempore.

Les paramètres suivants ont été étudiés : concentration cytotoxique 50-CC50, si possible (concentration empêchant la mort de 50% des cellules MT-2), concentration maximale non toxique-MNC, et concentration inhibitrice 50-IC50 (concentration inhibant de 50% la réplication virale). La CC50 et la MNC ont été détectées par le test d’absorption du MTT . La CI50 a été étudiée sur des cellules MT-4 par un test d’infection en microtitration explorant la protection des cellules contre l’effet cytopathique du VIH mesuré par le test MTT . Les expériences dans des conditions d’infection aiguë ont été réalisées dans des microplaques à 96 puits avec 6-8 parallèles/expérience. Des contrôles cellulaires (cellules MT-4 avec milieu uniquement) et des contrôles viraux (cellules MT-4 infectées par le virus) ont été effectués avec chaque expérience. Pour les tests antiviraux, le VIH a été ajouté à chaque puits pour obtenir une multiplicité d’infection de 0,1, sauf pour les contrôles cellulaires. La fixation du virus a été autorisée pendant une heure à 37°C/5% de CO2. Les plaques ont été incubées pendant 72 à 96 heures à 37°C/5% de CO2. Après cela, le test MTT a été réalisé comme décrit et l’absorbance des cellules viables a été mesurée par colorimétrie à A540 nm. Pour toutes les expériences, la valeur moyenne de chaque colonne a été calculée (uniquement si les valeurs en A540 ne différaient pas de ±10%). Pour les essais antiviraux, les valeurs moyennes des lignes expérimentales et des lignes de contrôle ont été comparées et le pourcentage de cellules protégées (survie cellulaire) sous la concentration appropriée de la substance a été tracé en fonction de la concentration de la substance pour obtenir la CI50. La survie cellulaire (% de protection cellulaire) a été calculée selon la formule suivante : =%cellprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) où 𝑋 est la valeur moyenne de l’A540 des cellules infectées par le VIH traitées avec la concentration appropriée du composé étudié ; le VIH témoin est la valeur moyenne de l’A540 des cellules infectées par le VIH sans ajout d’aucun composé ; la cellule témoin est la valeur moyenne de l’A540 des cellules non infectées et non traitées avec l’inhibiteur.

Comme substance référente, l’ABC (Abacavir bien connu inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse-INTI) et la pepstatine ont été utilisés.

4.4.1. Activité RT endogène et effet direct des composés sur la RT

Il a été testé par le test HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suède). Le kit contient de la RT recombinante (rRT) comme standard, ce qui rend possible la quantification de la RT. Pour le test RT endogène, les surnageants de cellules MT-4 infectées/non infectées par le VIH-1 après incubation avec/sans composés ont été testés conformément aux directives du fabricant. Le niveau d’activité RT dans le surnageant a été calculé (en pg/mL) à partir de l’étalon rRT du VIH-1 défini dans chaque kit. L’effet direct des composés sur l’activité rRT a été mesuré avec le même kit et visait à prouver que la RT est une cible de l’action antivirale. Des dilutions échelonnées appropriées de l’inhibiteur ont été préparées dans un tampon de contrôle et ajoutées au mélange réactionnel. La réaction a été conduite pendant 3 heures à 33°C.L’activité RT des dilutions standard a été comparée à celle où les composés ont été ajoutés ou aux contrôles (où seul le mélange d’incubation sans composés a été ajouté).

4.4.2. Détection de l’activité antiprotéase par des tests utilisant la PR virale native

Une méthode décrite précédemment par Broglia et al, 2006 , pour la détection de l’activité protéase recombinante a été modifiée pour utiliser la protéase virale native . Comme source de protéase native du VIH-1, une nouvelle suspension de stock viral concentré (50x) provenant de surnageants de cellules H9/HTLV IIIB chroniquement infectées a été utilisée. La lyse des particules virales et la libération de l’enzyme active (protéase) ont été réalisées à l’aide d’un tampon de rupture (lyse) contenant 2,5 % de Triton X-100 dans un tampon phosphate. La concentration du liquide de culture tissulaire contenant le virus a été réalisée par ultracentrifugation dans Biofuge Stratos, Heraeus, pendant 1 heure, à 4°C et 35000 tours/minute. Le culot a été remis en suspension pour obtenir un concentré 50x dans un tampon de dislocation.

Le mélange réactionnel suivant a été préparé pour chaque expérience : 1000 𝜇L de tampon phosphate (20 mM, pH 6.0) ; 20 𝜇L de substrat de protéase du VIH III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M ; Bachem, Suisse) dans du DMSO, préparé ex tempore ; 20 μL d’enzyme (stock de VIH) prélevée dans une solution contenant 25 𝜇L de tampon de dislocation (lyse) + 100 μL de stock de VIH, incubée 40 min à 37°C avant l’expérience.

L’activité PR du VIH-1 a été mesurée par lecture spectrophotométrique directe de l’utilisation du substrat de la réaction enzymatique à 300 nm, à température ambiante et à une longueur de trajet de 1 cm, à l’aide du spectrophotomètre T80 + UV-Vis (PG instruments). La vitesse initiale de réaction (V0) a été ajustée pour être de 0,0020-0,0030 ΔAbs/min en faisant varier l’activité enzymatique (concentration virale). Le composé testé et l’inhibiteur de référence (la pepstatine utilisée ici) ont été ajoutés au mélange réactionnel avant l’enzyme, afin d’effectuer le dépistage de l’effet inhibiteur. La CI50 a été définie comme la concentration du composé testé qui diminue la vitesse de la réaction de 50% de la vitesse initiale sans le composé testé (de référence).