L’acétylcholine est synthétisée à partir de l’acétyl coenzyme A et de la choline par l’enzyme choline acétyltransférase. Dans le système nerveux, on pense que cette enzyme existe principalement dans le cytoplasme des terminaisons nerveuses. Le coenzyme A est synthétisé dans les mitochondries et accède à la choline acétyltransférase après son transport à travers la membrane mitochondriale vers le cytoplasme. En plus de sa synthèse dans le foie, la choline employée dans la production d’acétylcholine est dérivée de sources alimentaires. Il existe un système de transport dans les cellules endothéliales capillaires qui est responsable du transport de la choline, sous sa forme libre et phospholipidique, dans le cerveau. L’hydrolyse des phospholipides contenant de la choline peut également libérer la choline qui est utilisée dans la synthèse de l’acétylcholine. Comme la choline acétyltransférase n’est pas saturée par les concentrations d’acétyl coenzyme A et de choline que l’on estime être présentes dans le terminal nerveux, il semble que le taux de synthèse de l’acétylcholine dépende de la disponibilité des précurseurs. L’activité enzymatique est également régulée par l’inhibition du produit ; en se fixant sur un site allostérique de la choline acétyltransférase, l’acétylcholine inhibe son activité. En outre, l’action de masse et l’activité neuronale influencent le taux de formation de l’acétylcholine. La régulation à court terme de l’activité enzymatique est en partie assurée par la phosphorylation induite par les protéines kinases. Il n’existe pas d’inhibiteurs très spécifiques et puissants de l’enzyme et il faut noter que le blocage pharmacologique de cette étape (par exemple avec la naphtylvinylpyridine) dans le cycle de vie de l’acétylcholine produit un effet moins profond sur le transmetteur que l’inhibition du transport de la choline.
Un transporteur d’acétylcholine spécifique de faible affinité est responsable de la captation du transmetteur du cytoplasme dans les vésicules. Les gènes de la choline acétyltransférase et du transporteur vésiculaire d’acétylcholine sont organisés dans un locus génique unique, et la transcription des deux gènes est généralement corégulée. Le (±)-vesamicol est un inhibiteur sélectif de ce transporteur, le L-(-)-vesamicol étant plus puissant que le D-(+)-vesamicol. Une fois emballée dans des vésicules, l’acétylcholine est soumise à une libération par exocytose induite par un stimulus. Plusieurs toxines puissantes ont un impact sur la libération d’acétylcholine, notamment la toxine botulique qui inhibe sa libération.
L’acétylcholinestérase neuronale inactive très rapidement la majorité de l’acétylcholine libérée dans le cerveau, bien que la butyrylcholinestérase contenue dans les cellules gliales puisse hydrolyser une petite proportion d’acétylcholine dans la synapse. En périphérie, l’acétylcholinestérase est présente dans les muscles qui reçoivent une innervation cholinergique, tandis que la butyrylcholinestérase est plus largement distribuée. On connaît un certain nombre d’inhibiteurs réversibles (par exemple physostigmine, BW284C51) et irréversibles (par exemple iso-OMPA) de l’acétylcholinestérase, et ces médicaments ont pour effet de prolonger les effets synaptiques de l’acétylcholine. Les anticholinestérasiques réversibles de deuxième génération tels que le donépézil, la rivastigmine (ENA 713), l’eptastigmine et la galantamine (galanthamine) sont employés comme traitements de la maladie d’Alzheimer. Certaines cholinestérases de deuxième génération ont été retirées de l’usage clinique en raison d’effets secondaires inacceptables (par exemple, la tacrine, le métrifonate). Les inhibiteurs irréversibles de l’acétylcholinestérase sont utilisés comme insecticides et agents de guerre chimique. La choline, qui est libérée de l’acétylcholine par l’acétylcholinestérase, est ramenée dans les terminaux cholinergiques par un transporteur à haute affinité, et réutilisée dans la synthèse des transmetteurs. L’hémicholinium-3 inhibe de manière puissante et réversible le transport de la choline, ce qui entraîne une diminution importante de la formation d’acétylcholine. Contrairement à l’hémicholinium-3, l’A-4 (un analogue bis 4-méthylpipéridine de l’HC-3), est actif après administration périphérique. Les analogues de la choline par la moutarde azotée sont de puissants inhibiteurs irréversibles de la captation de la choline de haute affinité.