Test d’activation des basophiles : provocation alimentaire en tube à essai ou outil de recherche spécialisé ?

L’étalon-or du diagnostic de l’allergie alimentaire est la provocation alimentaire orale (CAO) . Cependant, l’OFC nécessite l’ingestion de l’aliment suspecté d’être coupable et peut provoquer une réaction allergique aiguë, qui est potentiellement grave. Pour cette raison, la provocation alimentaire orale doit être réalisée dans un environnement supervisé disposant des installations et de l’expertise nécessaires pour traiter les réactions allergiques et l’anaphylaxie, le cas échéant. La CFO peut provoquer une anxiété importante chez les patients, les parents et même le personnel clinique, car elle comporte un risque considérable. Ainsi, dans la mesure du possible, le diagnostic d’allergie alimentaire est établi par une histoire récente et convaincante d’une réaction allergique à médiation IgE à l’aliment incriminé, associée à la preuve d’une sensibilisation IgE au même aliment par un test cutané (SPT) et/ou des IgE spécifiques sériques (sIgE). L’OFC est réservé aux cas où les résultats du SPT et/ou des sIgE sont équivoques. Avec la prise de conscience et l’augmentation de la prévalence de l’allergie et de la sensibilisation alimentaires, de plus en plus de patients sont testés pour l’allergie alimentaire. L’absence d’antécédents d’exposition orale à des aliments allergènes, que ce soit en raison d’une réaction allergique ou en l’absence de symptômes cliniques, peut rendre l’interprétation des résultats du SPT et des sIgE particulièrement difficile. Les nourrissons et les jeunes enfants qui n’ont jamais consommé certains aliments allergènes constituent une proportion considérable des patients vus dans les cliniques d’allergologie et ont souvent besoin d’un TFO pour clarifier leur statut allergique. Il en résulte une demande croissante pour la réalisation d’un CFO. Les services d’allergologie ont des difficultés à répondre à cette demande et les patients doivent parfois attendre plusieurs mois avant de se voir proposer un diagnostic exact d’allergie ou de tolérance alimentaire par l’OFC, ce qui peut entraîner des restrictions alimentaires inutiles et une anxiété importante liée à l’incertitude du diagnostic. L’OFC est également l’étalon-or pour évaluer la résolution de l’allergie alimentaire, pour déterminer la dose seuil et pour surveiller la réponse clinique aux traitements immunomodulateurs de l’allergie alimentaire. Dans les études de recherche, les patients allergiques doivent souvent être soumis à des tests répétés de la CFO pour évaluer toute amélioration clinique.

La MTD, étant un test fonctionnel, a le potentiel de ressembler plus étroitement au phénotype clinique des patients que les tests d’allergie qui détectent simplement la présence d’IgE spécifiques aux allergènes. En termes simples, la MTD peut être considérée comme un CFO dans un tube à essai, où au lieu de donner l’aliment à un enfant par la bouche, les basophiles impliqués dans les réactions allergiques aiguës sont exposés à un extrait alimentaire dans un tube à essai. Malgré l’analogie, des différences entre les deux procédures et leurs applications cliniques peuvent être soulignées et c’est ici que se pose la question de savoir si la MTD peut imiter loyalement l’OFC de référence, c’est-à-dire si la MTD peut reproduire in vitro la réaction allergique qui se produit in vivo lors d’un OFC positif.

Le test d’activation des basophiles

Le BAT est un test basé sur la cytométrie de flux où l’expression des marqueurs d’activation est mesurée à la surface des basophiles après stimulation avec un allergène -Fig. 1. Un test d’activation des basophiles positif peut être considéré comme un substitut in vitro d’une réaction allergique aiguë in vivo. Dans une étude sur des patients allergiques au venin d’hyménoptère, une régulation positive des marqueurs d’activation des basophiles a été observée à la fois in vitro après stimulation avec du venin de veste jaune ou d’abeille et ex vivo après une piqûre positive. Dans la même étude, il y avait une concordance générale entre la présentation clinique (réaction systémique contre réaction locale importante) et les résultats de la MTD, ce qui suggère que la MTD est un biomarqueur potentiel de l’anaphylaxie. De même, chez les patients allergiques aux aliments, une bonne concordance a été trouvée entre les résultats de la MTD et les résultats de la CFO. Chez les patients allergiques à l’alpha-gal présentant des réactions allergiques retardées de type immédiat à la viande rouge, l’activation des basophiles ex vivo dans le sang prélevé à différents moments coïncidait avec le développement de réactions allergiques systémiques in vivo pendant l’OFC . Les résultats de cette étude renforcent le rôle des basophiles dans les réactions allergiques médiées par les IgE et l’anaphylaxie induites par les aliments.

Différents marqueurs de surface cellulaire peuvent être utilisés pour identifier les basophiles dans le sang total, notamment IgE, CD123 (avec HLA-DR), CCR3 ou CRTH2 (avec CD3) ou CD203c .

Dans le sang périphérique, les IgE sont détectées sur les basophiles, les cellules dendritiques, les éosinophiles, les monocytes, les macrophages, les cellules B et les plaquettes, elles ne sont donc pas spécifiques des basophiles. CD123 est la sous-unité de faible affinité (α) du récepteur de l’IL-3. Il est exprimé à des niveaux élevés sur les cellules dendritiques plasmacytoïdes et les basophiles et à des niveaux faibles sur les monocytes, les éosinophiles, les cellules dendritiques myéloïdes et les sous-ensembles de cellules progénitrices hématologiques. Une coloration supplémentaire avec HLA-DR permet de distinguer les basophiles HLA-DR-négatifs des cellules dendritiques et des monocytes HLA-DR-positifs. CCR3 est le récepteur des chimiokines de type C-C (par exemple l’eotaxine, MCP et RANTES) et est fortement exprimé sur les basophiles et les éosinophiles mais aussi sur les cellules Th1 et Th2. CRTH2 est un autre marqueur qui est exprimé par les basophiles, les éosinophiles et les cellules T, et donc, comme CCR3, nécessite un marqueur de cellule T, tel que CD3, pour distinguer les basophiles des cellules T. CD203c est exprimé de manière constitutive et spécifique sur les basophiles et peut donc être utilisé comme un marqueur d’identification unique ou en combinaison avec d’autres marqueurs.

Après une stimulation avec un allergène, l’expression de différentes protéines est régulée à la hausse à la surface des basophiles , à savoir CD63 et CD203c . CD63 est une protéine membranaire associée aux lysosomes (LAMP), qui n’est pas exprimée à la surface des basophiles au repos mais uniquement sur la membrane des granules à l’intérieur des cellules . Lorsque les granules fusionnent avec la membrane plasmatique des basophiles au cours de la dégranulation, CD63 s’exprime à la surface des basophiles. CD203c est une enzyme qui clive les liaisons phosphodiester et phosphosulfate, en éliminant par hydrolyse les 5′-nucléotides successivement des 3′-hydroxy-terminaux des oligonucléotides. Il est exclusivement et constitutivement exprimé en faible quantité à la surface des basophiles et des mastocytes et son expression augmente avec l’activation cellulaire. Les marqueurs d’activation des basophiles semblent former deux groupes distincts de marqueurs qui sont régulés à la hausse de façon concomitante : l’un comprenant CD63, CD107a et CD107b et l’autre comprenant CD203c, CD13 et CD164 . CD63 et CD203c sont les marqueurs d’activation des basophiles les plus couramment utilisés.

La procédure de laboratoire de la MTB comprend trois étapes : la stimulation des cellules, la coloration des cellules et la cytométrie de flux-Fig. 1. Le sang doit être traité le plus rapidement possible après le prélèvement, car les basophiles perdent leur viabilité et leur réactivité avec le temps. Cependant, des études ont été réalisées avec des échantillons conservés à +4 °C jusqu’à 24 h . Un petit volume de sang (environ 1-2 ml selon le nombre de conditions) est nécessaire pour la MTD. Des extraits d’allergènes bruts ou des allergènes purifiés ou recombinants peuvent être utilisés pour la stimulation cellulaire. Différentes concentrations d’allergènes doivent être utilisées, car la sensibilité des basophiles à la stimulation allergénique spécifique varie selon les patients.

Les résultats de la MTD peuvent être déterminés en termes de pourcentage de basophiles exprimant le marqueur d’activation défini ou en termes d’intensité de fluorescence moyenne (IFM) en calculant l’indice de stimulation, c’est-à-dire le rapport entre l’IFM de la condition sélectionnée et l’IFM du contrôle négatif. La première méthode est généralement utilisée pour le CD63 car celui-ci n’est pas exprimé dans les cellules au repos et son expression après activation est bimodale. Le second est habituellement utilisé pour le CD203c qui est déjà exprimé dans les cellules au repos et son augmentation après stimulation allergénique est unimodale-Fig. 2.

Chez les patients allergiques, l’activation des basophiles induite par les allergènes se traduit généralement par une courbe dose-réponse en forme de cloche, avec des concentrations croissantes de l’allergène (généralement 5-6 log de différence) conduisant à une augmentation progressive de l’expression des marqueurs d’activation des basophiles jusqu’à atteindre un plateau-Fig. 3.

Il existe une grande variabilité de la réponse des basophiles aux allergènes entre les individus. Afin d’exprimer cette hétérogénéité et de comparer les réponses des basophiles entre différents patients, divers paramètres peuvent être déterminés sur la base de la courbe dose-réponse, tels que CD-max et EC50 (concentration efficace à 50 %) ou CDsens. CD-max est l’activation maximale et correspond à la proportion maximale de basophiles activés à n’importe quelle concentration d’allergène . La CE50 est la dose efficace à 50 % de l’activation maximale, et peut également être représentée par CDsens. Décrite pour la première fois par Johansson, CDsens est l’inverse de la concentration efficace semi-maximale, c’est-à-dire la concentration à laquelle l’activation des basophiles est égale à la moitié de l’activation maximale, multipliée par 100 : CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax et CDsens sont des mesures de la réactivité et de la sensibilité des basophiles, respectivement. La réactivité des basophiles peut être définie comme le degré d’activation des basophiles, c’est-à-dire la proportion de basophiles activés, et peut également être mesurée comme le pourcentage de basophiles CD63-positifs à différentes concentrations d’allergènes ou comme le rapport du pourcentage de CD63-positifs après stimulation avec un allergène et avec un anti-IgE. La sensibilité des basophiles se réfère à la concentration d’allergène à laquelle les basophiles sont activés et peut être exprimée en pourcentage de la dose maximale efficace (par exemple EC5, EC10) en dehors de EC50 et CDsens, mentionnés précédemment. La figure 3 représente la réponse des basophiles de deux individus différents, l’un avec une réactivité et une sensibilité des basophiles plus élevées (bleu) et l’autre avec une réactivité et une sensibilité des basophiles plus faibles (rouge), c’est-à-dire avec une plus petite proportion de basophiles s’activant en réponse à des concentrations plus élevées de l’allergène. Shreffler et Patil ont proposé un nouveau paramètre pour mesurer les réponses des basophiles, l’aire sous la courbe dose-réponse, qui a l’avantage de combiner la réactivité des basophiles et la sensibilité des basophiles.

Utilisation du test d’activation des basophiles pour diagnostiquer les allergies alimentaires

Dans une étude récemment publiée , nous avons évalué l’utilité du BAT pour diagnostiquer l’allergie à l’arachide dans une population bien caractérisée d’enfants allergiques à l’arachide, sensibilisés à l’arachide et non sensibilisés. La MTD a montré une grande précision (97 %) dans le diagnostic de l’allergie à l’arachide et a permis de réduire de 66 % le nombre d’OFC nécessaires. Nous avons validé les seuils diagnostiques dans une population recrutée de manière prospective et indépendante et la performance diagnostique de la MTD était encore très bonne dans cette deuxième population d’étude. Au cours des dernières années, d’autres études ont évalué la performance de la MTD dans le diagnostic de l’allergie à différents aliments, notamment l’arachide, le lait de vache, l’œuf, le blé, la noisette, les crustacés et la pêche, ainsi que dans le diagnostic des syndromes pollen-aliment -Tableau 1. Des rapports de cas et de petites séries de cas ont suggéré que la MTD peut également être utile pour diagnostiquer l’allergie au sésame et à des déclencheurs moins courants de réactions allergiques alimentaires médiées par les IgE, tels que le riz et les galacto-oligosaccharides à chaîne courte présents dans les prébiotiques. Un document de position récemment publié par l’Académie européenne d’allergie et d’immunologie clinique passe en revue les applications cliniques de la MTD .

Divers facteurs peuvent influencer la performance diagnostique et les valeurs seuils de la MTD dans différentes études, certains liés à la population étudiée, certains liés à la conception de l’étude, certains liés à la procédure de laboratoire et à la méthodologie adoptée pour les analyses de données-Tableau 2. Les études existantes sont hétérogènes dans la plupart de ces aspects, ce qui limite leur comparabilité et une application plus large des seuils de diagnostic déterminés dans des études spécifiques. Le critère de diagnostic de chaque allergie alimentaire est spécifique à l’allergène et la précision du diagnostic peut ne pas être la même pour différents allergènes. De plus, les seuils définis dans une population ne sont pas nécessairement transférables directement à une autre population provenant d’un lieu géographique différent et évaluée dans un centre d’allergologie différent. Une des limites de la MTD est le fait qu’une petite proportion de patients testés ont des basophiles non répondeurs (c’est-à-dire des basophiles qui répondent à un contrôle positif non médié par les IgE mais pas aux stimulants médiés par les IgE) et ont donc un résultat ininterprétable pour le test. D’autres défis à relever pour faire passer la MTD d’une méthode de recherche à un test de diagnostic en clinique sont liés à la standardisation du test et à sa reproductibilité, ainsi qu’au rapport coût-efficacité de l’inclusion de la MTD dans l’approche diagnostique des patients suspectés d’allergie alimentaire. Ces aspects n’ont pas encore été établis et nécessitent des recherches supplémentaires.

La méthodologie adoptée pour réaliser la procédure de laboratoire et pour analyser les données de cytométrie en flux peut avoir un impact significatif sur les résultats obtenus pour la MTD et, par conséquent, dans sa précision diagnostique. Par exemple, l’identification des basophiles à l’aide d’un anticorps anti-IgE peut activer les cellules et modifier les résultats obtenus avec une méthode différente pour identifier les basophiles. L’expression de certains marqueurs d’identification des basophiles, tels que CCR3 et CD123, peut changer après l’activation des basophiles. Dans une étude récente, nous avons décrit que chez environ un quart des patients, l’expression de CD123, telle que détectée par cytométrie en flux, peut être réduite après l’activation des basophiles et donc conduire à une perte significative de cellules activées en utilisant des méthodes qui reposent sur ce marqueur pour identifier les basophiles. Cela pourrait entraîner une augmentation du nombre de diagnostics erronés, en particulier des faux négatifs, avec des conséquences importantes pour les patients individuels. L’ajout du marqueur spécifique des basophiles CD203c à la stratégie de sélection a permis de conserver le nombre de cellules et de réduire le nombre de faux négatifs (de 5 à 1 %). La stratégie de sélection modifiée a amélioré à la fois la sensibilité (de 88 à 98 %) et la spécificité (de 94 à 96 %) de la MTD, ce qui a entraîné une amélioration globale de la précision de la MTD pour diagnostiquer l’allergie à l’arachide de 91 à 97 % – Fig. 4. Afin de mener et d’interpréter la MTD avec succès, « le diable est dans les détails » ; il est donc très important de considérer soigneusement les aspects méthodologiques de la MTD.

Dans l’ensemble, en tant que test diagnostique, la MTD a montré une spécificité et une valeur prédictive positive élevées. Nous avons validé les seuils diagnostiques déterminés pour l’allergie à l’arachide dans une population indépendante recrutée prospectivement et la spécificité et la valeur prédictive positive de la MTD ont atteint 100 %. La spécificité élevée est un complément important aux tests d’allergie existants, tels que le SPT et les sIgE, qui ont une sensibilité élevée mais ne sont pas très spécifiques. La spécificité élevée implique qu’une MTD positive confirme avec certitude le diagnostic d’allergie alimentaire, mais qu’une MTD négative ne l’exclut pas nécessairement. En fonction du rapport coût-bénéfice et des aspects de sécurité, la CFO peut être réalisée chez les patients où la MTD fournit un résultat non concluant (à savoir les patients avec des basophiles non répondeurs) ou chez les patients où la MTD fournit un résultat non concluant et chez les patients où la MTD était négative.

L’approche pour décider de la nécessité d’un CFO après une MTD dépend également de la manière dont le résultat de la MTD est considéré dans le contexte des résultats des autres tests d’allergie, soit en combinaison, lorsque tous les résultats disponibles sont considérés simultanément, soit de manière séquentielle, lorsque la MTD n’est réalisée que chez les patients qui ont eu des résultats équivoques ou discordants pour les autres tests d’allergie. Dans notre étude sur l’arachide citée précédemment, nous avons comparé les performances de la MTD à celles d’autres tests d’allergie réalisés en parallèle. La MTD a donné de meilleurs résultats que le TSP, les IgE spécifiques à l’arachide et les IgE spécifiques à l’Ara h 2 et aux autres composants de l’arachide. Si l’on considère les tests individuels, le test de diagnostic le plus précis était la MTD. Afin de tirer le meilleur parti des informations disponibles, les résultats de la MTD peuvent être utilisés en combinaison avec les résultats d’autres tests. Cependant, en général, plus on utilise de tests, plus l’incertitude diagnostique est élevée (et plus le nombre de BAT est important) étant donné que différents tests peuvent fournir des résultats contradictoires . Mieux que de combiner les résultats des tests d’allergie simultanément, il peut être préférable d’utiliser les MTD séquentiellement dans le bilan diagnostique de l’allergie alimentaire, chez les patients dont les résultats des autres tests d’allergie ne sont pas concluants . Cette approche peut être avantageuse également du point de vue de la faisabilité, compte tenu des aspects pratiques liés à la réalisation de la MTD, à savoir le besoin de sang frais et les ressources et l’expertise technique requises. Il ne serait pas pratique, ni même nécessaire, de réaliser la MTD chez tous les patients chez qui l’on soupçonne une allergie alimentaire. La MTD peut être réservée à certains cas, notamment lorsqu’il n’y a pas d’antécédents d’exposition orale à l’aliment ou que l’histoire clinique n’est pas claire et que les résultats du TSP et des IgE spécifiques ne sont pas concluants. La MTD pourrait être utilisée comme deuxième étape du bilan diagnostique, après l’histoire clinique et le SPT et/ou les IgE spécifiques, dans les cas difficiles, avant de décider si un CFO est nécessaire -Fig. 5. La précision diagnostique et la supériorité de la BAT par rapport au test cutané et aux IgE spécifiques doivent être évaluées avec d’autres allergènes et dans d’autres contextes cliniques.

En plus de distinguer les patients allergiques et tolérants aux aliments, les résultats de la MTD peuvent fournir des informations supplémentaires sur les caractéristiques des réactions induites par les aliments qui peuvent être utiles dans la gestion des patients allergiques . Il a été démontré que différents paramètres de la MTD reflètent différentes caractéristiques des réactions allergiques, la proportion de basophiles activés (réactivité des basophiles) reflétant la gravité des symptômes allergiques et la dose à laquelle les basophiles réagissent à l’allergène in vitro (sensibilité des basophiles) reflétant la dose de protéine alimentaire à laquelle les patients ont réagi pendant la CFO . Ces résultats concernant l’allergie à l’arachide ont été reproduits dans une étude publiée ultérieurement et peuvent être applicables à d’autres allergies alimentaires. Dans tous les cas, le résultat de la BAT doit être pris en compte dans le contexte des autres caractéristiques cliniques et des facteurs de risque de gravité, lors de l’évaluation des patients allergiques aux aliments.

Utilisation du test d’activation des basophiles pour surveiller l’acquisition de la tolérance aux aliments et la réponse clinique aux traitements immunomodulateurs de l’allergie alimentaire

Reflétant étroitement le phénotype clinique des patients allergiques et tolérants, La MTD peut être utile pour évaluer la résolution naturelle des allergies alimentaires qui sont généralement dépassées avec le temps, telles que les allergies au lait de vache, aux œufs et au blé, et pour déterminer le moment où il convient de soumettre les patients à une nouvelle épreuve pour évaluer si l’aliment peut être réintroduit dans le régime alimentaire. La BAT a permis de distinguer différents phénotypes de patients allergiques au lait de vache et aux œufs, à savoir les patients qui tolèrent les formes fortement chauffées de ces aliments tout en réagissant aux aliments non chauffés et les patients qui réagissent à la fois au lait ou aux œufs fortement chauffés et non chauffés.

La BAT a également été utilisée pour surveiller la réponse clinique aux traitements immunomodulateurs des allergies alimentaires dans le cadre d’études de recherche. Dans l’ensemble, dans les études d’immunothérapie aux aliments tels que l’arachide, le lait de vache et l’œuf, la BAT a montré une diminution de la réactivité des basophiles aux allergènes alimentaires respectifs avec le traitement, ce qui est particulièrement évident aux plus faibles concentrations de l’allergène, reflétant la diminution de la sensibilité des basophiles. Il est intéressant de noter que Thyagarajan et al. ont montré que, pendant la TIO à l’arachide, la réduction de l’activation des basophiles ne se produisait pas seulement en réponse à l’arachide, mais aussi à l’allergène de l’œuf (chez les patients allergiques à l’œuf) et aux anti-IgE, mais pas au contrôle positif non médié par les IgE, le fMLP (formyl-méthionyl-leucyl-phénylalanine), ce qui suggère que la voie en aval du récepteur des IgE est devenue anergique. Dans une étude sur l’omalizumab chez des patients allergiques à l’arachide, l’expression de CD203c dans la MTB a diminué pendant le traitement et est revenue aux niveaux d’avant le traitement après l’arrêt de celui-ci. Enfin, le médicament chinois à base de plantes FAHF-2 a également montré un effet inhibiteur significatif de la réponse des basophiles chez les patients allergiques à différents aliments, parallèlement à l’amélioration clinique.

Ensemble, ces études illustrent le fait que les MTD peuvent être répétées chez les mêmes patients au fil du temps pour évaluer les changements de la réponse immunitaire aux allergènes alimentaires avec une sorte d’intervention, qu’il s’agisse d’immunothérapie orale, d’immunothérapie sublinguale, d’omalizumab ou d’autres stratégies thérapeutiques ou préventives immunomodulatrices.

Perspectives futures

Dans l’optique d’appliquer la MTD au diagnostic de l’allergie alimentaire en pratique clinique, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour définir et valider les seuils de diagnostic pour des allergènes spécifiques et dans différentes populations de patients. La standardisation des procédures de laboratoire serait importante pour permettre la comparabilité des résultats de la MTD entre les centres. Cela nécessiterait la normalisation du protocole de l’essai in vitro et des méthodes de cytométrie en flux et d’analyse des données. L’utilisation d’une méthodologie similaire pour la MTD permettrait de comparer les résultats de la MTD dans différents centres, à la fois à des fins cliniques et de recherche, y compris dans des études multicentriques.

Une fois validée de manière appropriée pour le diagnostic des allergies alimentaires spécifiques, la MTD peut être utilisée pour surveiller la réponse clinique aux traitements immunomodulateurs tels que l’immunothérapie spécifique aux allergènes et les produits biologiques. La MTD a également un énorme potentiel pour les études mécanistiques afin d’améliorer notre compréhension du rôle des basophiles dans les mécanismes immunitaires de l’allergie alimentaire et de la tolérance alimentaire.