U.S. Food and Drug Administration

July 2000

Principes toxicologiques pour l’évaluation de la sécurité des ingrédients alimentairesRedbook 2000Chapitre IV.C.1..d. Test du micronoyau des érythrocytes de mammifères

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I. Introduction

Les micronoyaux sont des corps cytoplasmiques contenant de la chromatine, formés lorsque des fragments de chromosomes acentriques ou des chromosomes se décalent pendant l’anaphase et ne parviennent pas à s’incorporer aux noyaux des cellules filles pendant la division cellulaire. Étant donné que les dommages génétiques qui entraînent des cassures chromosomiques, des chromosomes structurellement anormaux ou des anomalies du fuseau conduisent à la formation de micronoyaux, l’incidence des micronoyaux sert d’indice de ces types de dommages. Il a été établi que pratiquement tous les agents qui provoquent des cassures chromosomiques double brin (clastogènes) induisent des micronoyaux. Parce que l’énumération des micronoyaux est beaucoup plus rapide et moins exigeante techniquement que la notation des aberrations chromosomiques, et parce que les micronoyaux proviennent de deux types importants de dommages génétiques (clastogenèse et perturbation du fuseau), le test du micronoyau a été largement utilisé pour dépister les produits chimiques qui causent ces types de dommages.

Ces directives traitent du test du micronoyau in vivo le plus largement utilisé : le test du micronoyau des érythrocytes de mammifères. Ce test du micronoyau in vivo est utilisé pour la détection des dommages induits par la substance d’essai sur les chromosomes ou l’appareil mitotique des érythroblastes par l’analyse des érythrocytes tels qu’ils sont prélevés dans la moelle osseuse et/ou les cellules du sang périphérique des animaux, généralement des rongeurs.

Le but du test du micronoyau est d’identifier les substances qui causent des dommages cytogénétiques qui entraînent la formation de micronoyaux contenant des fragments de chromosomes retardés ou des chromosomes entiers.

Lorsqu’un érythroblaste de la moelle osseuse se développe en un érythrocyte polychromatique, le noyau principal est extrudé ; les micronoyaux qui ont été formés peuvent rester derrière dans le cytoplasme autrement énucléé. La visualisation des micronoyaux est facilitée dans ces cellules par des techniques de coloration spécifiques et parce qu’elles n’ont pas de noyau principal. Une augmentation de la fréquence des érythrocytes polychromatiques micronucléés chez les animaux traités est une indication de dommages chromosomiques induits.

II. Définitions

Le centromère (Kinetochore) est une ou plusieurs régions d’un chromosome avec lesquelles les fibres du fuseau sont associées pendant la division cellulaire, permettant le mouvement ordonné des chromosomes filles vers les pôles des cellules filles.

Les micronoyaux sont de petits noyaux, séparés et additionnels aux noyaux principaux des cellules, produits pendant la télophase de la mitose (méiose) par des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers en retard.

L’érythrocyte normochromatique est un érythrocyte mature dépourvu de ribosomes et qui peut être distingué des érythrocytes immatures, polychromatiques, par des colorations sélectives des ribosomes.

L’érythrocyte polychromatique est un érythrocyte immature, à un stade intermédiaire de développement, qui contient encore des ribosomes et peut donc être distingué des érythrocytes matures, normochromatiques, par des colorations sélectives pour les ribosomes.

III. Considérations initiales

La moelle osseuse des rongeurs est couramment utilisée dans ce test puisque les érythrocytes polychromatiques sont produits dans ce tissu. La mesure des érythrocytes immatures micronucléés (polychromatiques) dans le sang périphérique est également acceptable chez toute espèce chez laquelle l’incapacité de la rate à éliminer les érythrocytes micronucléés a été démontrée, ou qui a montré une sensibilité adéquate pour détecter les agents qui provoquent des aberrations chromosomiques structurelles et/ou numériques. Les micronoyaux peuvent être distingués par un certain nombre de critères. Ceux-ci incluent l’identification de la présence ou de l’absence d’un kinétochore ou d’ADN centromérique dans les micronoyaux. La fréquence des érythrocytes immatures (polychromatiques) micronucléés est le principal critère d’évaluation. Le nombre d’érythrocytes matures (normochromatiques) dans le sang périphérique qui contiennent des micronoyaux parmi un nombre donné d’érythrocytes matures peut également être utilisé comme critère d’évaluation de l’essai lorsque les animaux sont traités en continu pendant une période qui dépasse la durée de vie de l’érythrocyte chez l’espèce considérée (par exemple, 4 semaines chez la souris), à condition qu’une sélection splénique significative contre les érythrocytes micronucléés ne se produise pas dans cette espèce/souche. Les conséquences de la sélection splénique, si elle se produit, doivent être pleinement prises en compte.

Ce test du micronoyau in vivo chez les mammifères est particulièrement pertinent pour évaluer le danger mutagène car il permet de prendre en compte les facteurs du métabolisme in vivo, de la pharmacocinétique et des processus de réparation de l’ADN, bien que ceux-ci puissent varier selon les espèces, les tissus et les paramètres génétiques. Un essai in vivo est également utile pour approfondir un effet mutagène détecté par un système in vitro.

S’il existe des preuves que la substance d’essai, ou un métabolite réactif, n’atteindra pas le tissu cible, il n’est pas approprié d’utiliser cet essai.

IV. Principe de la méthode d’essai

Les animaux sont exposés à la substance d’essai par une voie appropriée. Si la moelle osseuse est utilisée, les animaux sont sacrifiés à des moments appropriés après le traitement, la moelle osseuse est extraite et des préparations sont faites et colorées.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Lorsque du sang périphérique est utilisé, le sang est prélevé à des moments appropriés après le traitement et des préparations de frottis sont faites et colorées.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) Les préparations sont analysées pour la présence de micronoyaux.

V. Description de la méthode

A. Préparations

1. Sélection des espèces animales

Historiquement, les souris ou les rats ont été utilisés en routine pour ce test. Si la moelle osseuse est le tissu prélevé, toute espèce mammifère appropriée peut être utilisée (voir section III., ci-dessus). Comme pour toute étude toxicologique, le choix de l’espèce appropriée doit être justifié. Lorsque le sang périphérique est utilisé, les souris sont recommandées. Cependant, toute espèce mammalienne appropriée peut être utilisée à condition qu’il s’agisse d’une espèce dont la rate n’élimine pas les érythrocytes micronucléés ou d’une espèce qui a montré une sensibilité adéquate pour détecter les agents qui provoquent des aberrations chromosomiques structurelles et/ou numériques. Il convient d’utiliser des souches de laboratoire couramment utilisées de jeunes animaux sains. Au début de l’étude, la variation de poids des animaux doit être minimale et ne pas dépasser ±20% du poids moyen de chaque sexe.

2. Conditions de logement et d’alimentation

La température de la salle des animaux d’expérience doit être appropriée à l’espèce utilisée ; pour les souris et les rats, elle doit être de 22°C (±3°C). L’humidité relative devrait être d’au moins 30 % et, de préférence, ne pas dépasser 70 %, sauf pendant le nettoyage de la salle, l’objectif étant de 50 à 60 %. L’éclairage doit être artificiel, la séquence étant de 12 heures de lumière, 12 heures d’obscurité. Pour l’alimentation, on peut utiliser des régimes conventionnels de laboratoire avec un approvisionnement illimité en eau potable. Le choix du régime alimentaire peut être influencé par la nécessité d’assurer un mélange approprié d’une substance d’essai lorsqu’elle est administrée par cette voie. Les animaux peuvent être logés individuellement, ou mis en cage en petits groupes du même sexe.

3. Préparation des animaux

Des animaux adultes jeunes et en bonne santé doivent être répartis au hasard dans les groupes de contrôle et de traitement. Les animaux doivent être identifiés de façon unique. Les animaux doivent être acclimatés aux conditions de laboratoire pendant au moins cinq jours. Les cages doivent être disposées de manière à minimiser les effets possibles dus à l’emplacement des cages.

4. Préparation des doses

Les substances d’essai solides doivent être dissoutes ou mises en suspension dans des solvants ou des véhicules appropriés et diluées, si nécessaire, avant l’administration des doses aux animaux. Les substances d’essai liquides peuvent être dosées directement ou diluées avant l’administration des doses. Des préparations fraîches de la substance d’essai doivent être employées, sauf si les données de stabilité démontrent l’acceptabilité du stockage.

B. Conditions d’essai

1. Solvant/véhicule

Le solvant/véhicule ne doit pas produire d’effets toxiques aux niveaux de dose utilisés, et ne doit pas être suspecté de réaction chimique avec la substance d’essai. Si des solvants/véhicules autres que ceux couramment employés sont utilisés, leur utilisation doit être étayée par des données de référence indiquant leur compatibilité avec la substance d’essai et les animaux. Il est recommandé, lorsque cela est approprié, d’envisager d’abord l’utilisation d’un solvant/véhicule aqueux.

2. Contrôles

Des contrôles positifs et négatifs (solvant/véhicule) concomitants doivent généralement être inclus pour chaque sexe dans chaque essai réalisé avec des rongeurs. Cependant, lorsque le test du micronoyau est réalisé dans le cadre d’une étude de toxicité générale selon les directives des BPL, la vérification de la posologie appropriée sera alors effectuée par analyse chimique. Dans ce cas, le traitement simultané des animaux avec un agent de contrôle positif peut ne pas être nécessaire et le contrôle des procédures de coloration et de notation peut être réalisé en incluant des échantillons de référence appropriés obtenus précédemment sur des animaux qui ne font pas partie de l’expérience en cours. Dans les études portant sur des espèces supérieures, telles que les primates ou les chiens, les témoins positifs peuvent être omis à condition que le laboratoire d’essai ait démontré précédemment une réponse acceptable aux substances témoins positives de l’espèce utilisée. Dans tous les cas, les contrôles négatifs simultanés sont une composante obligatoire de l’étude. A l’exception du traitement avec la substance d’essai, les animaux des groupes témoins doivent être manipulés de manière identique aux animaux des groupes de traitement.

Les témoins positifs doivent produire des micronoyaux in vivo à des niveaux d’exposition censés donner une augmentation détectable et statistiquement significative par rapport au bruit de fond. Les doses de contrôle positif doivent être choisies de manière à ce que les effets soient clairs mais ne révèlent pas immédiatement au lecteur l’identité des lames codées. Il est acceptable que le contrôle positif soit administré par une voie différente de celle de la substance à tester et qu’il ne soit échantillonné qu’à un seul moment. En outre, l’utilisation de substances témoins positives liées à la classe chimique peut être envisagée, lorsqu’elles sont disponibles. Des exemples de substances de contrôle positif comprennent :

Animaux témoins négatifs, traités avec le solvant ou le véhicule seul et autrement traités de la même manière que les groupes de traitement, doivent être inclus pour chaque temps d’échantillonnage, sauf que, dans des circonstances appropriées, il peut être possible d’utiliser un animal comme son propre contrôle en comparant les échantillons pré-traitement et post-traitement. Si un échantillonnage unique est appliqué pour les témoins négatifs, le moment d’échantillonnage choisi doit être justifié. En outre, des témoins non traités doivent également être utilisés, à moins qu’il n’existe (a) des données disponibles auprès du laboratoire d’essai, ou (b) des données de contrôle historiques ou publiées démontrant qu’aucun effet délétère ou mutagène n’est induit par le solvant/véhicule choisi.

Si le sang périphérique est utilisé, un échantillon pré-traitement peut également être acceptable comme témoin négatif simultané, mais uniquement dans les études de sang périphérique de courte durée (par ex, 1-3 traitement(s)) lorsque les données résultantes se situent dans la fourchette attendue pour le témoin historique et lorsque l’absence d’un effet de solvant a été démontrée.

VI. Procédure pour les rats et les souris

Les sections suivantes fournissent des conseils pour les procédures chez les souris et les rats, les espèces les plus couramment utilisées dans ce test.

A. Nombre et sexe des animaux

Chaque groupe traité et témoin doit comprendre au moins 5 animaux analysables par sexe.(12) Si, au moment de l’étude, il existe des données provenant d’études sur la même espèce et utilisant la même voie d’exposition qui démontrent qu’il n’y a pas de différences substantielles entre les sexes en matière de toxicité, alors l’essai sur un seul sexe sera suffisant.

B. Programme de traitement

Plusieurs programmes de traitement différents (c’est-à-dire 1, 2 ou plusieurs traitements à intervalles de 24 heures) peuvent être recommandés. Les échantillons provenant de régimes à doses prolongées sont acceptables tant qu’un effet positif a été démontré pour cette étude ou, pour une étude négative, tant que la toxicité a été démontrée ou que la dose limite (voir section « D », ci-dessous) a été utilisée et que le dosage a été poursuivi jusqu’au moment du prélèvement. Ceci est basé sur des études montrant que des expositions répétées de souris et de rats jusqu’à une durée subchronique ont produit des effets d’une ampleur similaire à ceux obtenus avec l’essai aigu traditionnel.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Cependant, comme on craint que la sensibilité ne soit réduite dans les études à plus long terme en raison de l’impossibilité d’atteindre une véritable DME, ou parce qu’une adaptation peut se produire, on considère actuellement que la durée du traitement doit être limitée à quatre semaines jusqu’à ce que la sensibilité du test soit confirmée lorsque des traitements plus longs sont utilisés.(12)

Les substances à tester peuvent également être administrées sous forme de dose fractionnée, c’est-à-dire, deux ou plusieurs traitements le même jour séparés par quelques heures au maximum, pour faciliter l’administration d’un grand volume de matière ou pour minimiser les fluctuations des niveaux sanguins de l’article à tester.

Les deux façons dont le test peut être réalisé sont :

• Les animaux sont traités avec la substance à tester une fois, ou deux fois à un intervalle ne dépassant pas 24 heures. Des échantillons de moelle osseuse sont prélevés au moins deux fois entre 24 et 48 heures après la dernière dose, avec un ou plusieurs intervalles appropriés entre les échantillons. L’utilisation de périodes de prélèvement plus tôt que 24 heures après le traitement doit être justifiée. Des échantillons de sang périphérique sont prélevés au moins deux fois entre 36 et 72 heures après le dernier traitement, avec un ou plusieurs intervalles appropriés entre les échantillons. Lorsqu’une réponse positive est reconnue lors d’un prélèvement, il n’est pas nécessaire de procéder à des prélèvements supplémentaires.
• Si trois traitements quotidiens ou plus sont utilisés (par exemple, trois traitements ou plus à intervalles de 24 heures), les échantillons peuvent être prélevés une fois au plus tard 24 heures après le traitement final pour la moelle osseuse et une fois au plus tard 40 heures après le traitement final pour le sang périphérique.(12), (20)

Des temps d’échantillonnage supplémentaires peuvent être utilisés, lorsque cela est pertinent et scientifiquement justifié.

C. Niveaux de dose

Si une étude de recherche d’une gamme de doses est réalisée parce qu’il n’y a pas de données appropriées disponibles, elle doit être réalisée dans le même laboratoire, en utilisant les mêmes espèces, la même souche, le même sexe et le même régime de traitement qui seront utilisés dans l’étude principale.(7) En cas de toxicité, trois niveaux de dose doivent être utilisés pour le premier temps d’échantillonnage. Ces niveaux de dose doivent couvrir une gamme allant d’une toxicité évidente à une toxicité faible ou nulle. Au moment de l’échantillonnage suivant, seule la dose la plus élevée doit être utilisée. La dose la plus élevée est définie comme la dose produisant des signes de toxicité tels que des niveaux de dose plus élevés, basés sur le même schéma d’administration, devraient produire une létalité. Les substances ayant des activités biologiques spécifiques à de faibles doses non toxiques (telles que les hormones et les mitogènes) peuvent faire exception aux critères d’établissement de la dose et doivent être évaluées au cas par cas. La dose la plus élevée peut également être définie comme une dose qui produit une certaine indication de toxicité de la moelle osseuse (par exemple, une réduction de la proportion d’érythrocytes immatures parmi les érythrocytes totaux dans la moelle osseuse ou le sang périphérique).

D. Test limite

Si aucun effet toxique observable ne résulte d’un traitement unique avec un niveau de dose d’au moins 2000 mg/kg de poids corporel, ou de deux traitements le même jour, et si la génotoxicité ne serait pas attendue sur la base de données provenant de substances structurellement apparentées, alors une étude complète utilisant 3 niveaux de dose peut ne pas être nécessaire. Pour les études de plus longue durée, la dose limite est de 2000 mg/kg de poids corporel/jour pour un traitement allant jusqu’à 14 jours, et de 1000 mg/kg de poids corporel/jour pour un traitement de plus de 14 jours. L’exposition humaine attendue peut indiquer la nécessité d’utiliser un niveau de dose plus élevé dans l’essai limite.

E. Administration des doses

La substance à tester est généralement administrée par gavage à l’aide d’une sonde gastrique ou d’une canule d’intubation appropriée, ou par injection intrapéritonéale. D’autres voies d’exposition peuvent être acceptables lorsqu’elles peuvent être justifiées. Le volume maximal de liquide qui peut être administré par gavage ou par injection en une seule fois dépend de la taille de l’animal testé. Le volume ne doit pas dépasser 2 ml/100g de poids corporel. L’utilisation de volumes supérieurs à ceux-ci doit être justifiée. A l’exception des substances irritantes ou corrosives, qui révèleront normalement des effets exacerbés avec des concentrations plus élevées, la variabilité du volume d’essai doit être minimisée en ajustant la concentration pour assurer un volume constant à tous les niveaux de dose.

F. Préparation de la moelle osseuse/du sang

Les cellules de la moelle osseuse sont généralement obtenues à partir des fémurs ou des tibias immédiatement après le sacrifice. En général, les cellules sont prélevées sur les fémurs ou les tibias, préparées et colorées selon les méthodes établies. Le sang périphérique est obtenu à partir de la veine de la queue ou d’un autre vaisseau sanguin approprié. Les cellules sanguines sont immédiatement colorées par voie supravitale(4),(5),(14) ou des préparations de frottis sont réalisées et ensuite colorées. L’utilisation d’une coloration spécifique de l’ADN (par exemple, l’orange acridine(15) ou le Hoechst 33258 plus la pyronine-Y(30)) peut éliminer certains des artefacts associés à l’utilisation d’une coloration non spécifique de l’ADN. Cet avantage n’exclut pas l’utilisation de colorants classiques (par exemple, Giemsa). Des systèmes supplémentaires (par ex, colonnes de cellulose pour éliminer les cellules nucléées(36)) peuvent également être utilisés à condition que ces systèmes se soient avérés fonctionner de manière adéquate pour la préparation des micronoyaux en laboratoire.

G. Analyse

La proportion d’érythrocytes immatures parmi le total (immatures + matures) est déterminée pour chaque animal en comptant un total d’au moins 200 érythrocytes pour la moelle osseuse et 1000 érythrocytes pour le sang périphérique.(9) Toutes les lames, y compris celles des contrôles positifs et négatifs, doivent être codées indépendamment avant l’analyse microscopique. Au moins 2000 érythrocytes immatures par animal sont notés pour l’incidence des érythrocytes immatures micronucléés. Des informations supplémentaires peuvent être obtenues en notant les érythrocytes matures pour les micronoyaux. Lors de l’analyse des lames, la proportion d’érythrocytes immatures parmi les érythrocytes totaux ne doit pas être inférieure à 20 % de la valeur du contrôle. Lorsque les animaux sont traités en continu pendant 4 semaines ou plus, au moins 2000 érythrocytes matures par animal peuvent également être évalués pour l’incidence des micronoyaux. Les systèmes d’analyse automatisée (analyse d’image ou analyse cytométrique de flux des suspensions cellulaires) sont des alternatives acceptables à l’évaluation manuelle s’ils sont justifiés et validés de manière appropriée par rapport à la notation microscopique classique.(12)

VII. Procédure pour les espèces autres que les rats et les souris

Les informations publiées basées sur des études chez les souris, les rats, les hamsters, les porcs, les chiens, les primates non humains et les humains(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) indiquent que les fréquences spontanées et induites d’érythrocytes micronucléés sont similaires chez la plupart des espèces de mammifères, et suggèrent que la mesure de l’incidence des érythrocytes immatures micronucléés dans la moelle osseuse est appropriée pour évaluer les lésions chromosomiques ou du fuseau chez les espèces étudiées à ce jour. L’apparition et la disparition des érythrocytes micronucléés dans la moelle osseuse sont fonction de la cinétique de l’érythrogenèse et de la durée de vie des érythrocytes chez chaque espèce, et les schémas de dosage et d’échantillonnage doivent donc être modifiés en fonction des paramètres appropriés de la cinétique érythrocytaire pour chaque espèce. Des espèces autres que les souris ou les rats peuvent être utilisées lorsque cela est approprié, mais les informations suivantes doivent être incluses :

• Justification de l’espèce sélectionnée, et des schémas de dosage et d’échantillonnage utilisés en relation avec la cinétique de l’érythropoïèse et la durée de vie des érythrocytes dans l’espèce utilisée;
• Preuve que la fréquence des micronoyaux spontanés est cohérente avec les informations publiées, et/ou cohérente au sein du laboratoire qui mène l’étude ;
• Preuves que des génotoxiques connus produisent une augmentation de la fréquence des micronoyaux chez l’espèce utilisée, et valeurs de référence pour l’ampleur de la réponse induite ;
• Impact de l’élimination sélective splénique des cellules micronucléées du sang périphérique (lorsque ce dernier sert de tissu à surveiller).

VIII. Données et rapports

A. Résultats du traitement

Les données individuelles des animaux doivent être présentées sous forme de tableaux. L’unité expérimentale est l’animal. Le nombre d’érythrocytes immatures marqués, le nombre d’érythrocytes immatures micronucléés et le nombre d’immatures parmi les érythrocytes totaux doivent être énumérés séparément pour chaque animal analysé. Lorsque les animaux sont traités de façon continue pendant 4 semaines ou plus, les données sur les érythrocytes matures doivent également être indiquées si elles sont recueillies. La proportion d’érythrocytes immatures par rapport au nombre total d’érythrocytes et, si cela est jugé applicable, le pourcentage d’érythrocytes matures micronucléés doivent être indiqués pour chaque animal. S’il n’y a pas de preuve d’une différence de réponse entre les sexes, les données des deux sexes peuvent être combinées pour l’analyse statistique.

B. Évaluation et interprétation des résultats

Il existe plusieurs critères pour déterminer un résultat positif, comme une augmentation liée à la dose du nombre de cellules micronucléées ou une nette augmentation du nombre de cellules micronucléées dans un seul groupe de dose à un seul moment de prélèvement. Des méthodes statistiques doivent être utilisées pour évaluer les résultats des tests.(24),(35) Les critères statistiques d’un résultat positif, négatif ou équivoque doivent être clairement indiqués dans le protocole. Comme des facteurs biologiques peuvent modifier l’interprétation, la signification statistique ne doit pas être le seul facteur déterminant pour arriver à une conclusion. Les résultats équivoques doivent être clarifiés par des tests supplémentaires, en utilisant une modification des conditions expérimentales si nécessaire.

Bien que la plupart des expériences donnent des résultats clairement positifs ou négatifs, dans de rares cas, l’ensemble des données ne permet pas de porter un jugement définitif sur l’activité de la substance testée. Les résultats peuvent rester équivoques ou douteux quel que soit le nombre de fois où l’expérience est répétée.

Les résultats positifs au test du micronoyau indiquent qu’une substance induit des micronoyaux, qui sont le résultat de dommages chromosomiques ou de dommages à l’appareil mitotique dans les érythroblastes de l’espèce testée. Des résultats négatifs indiquent que, dans les conditions de l’essai, la substance testée ne produit pas de dommages chromosomiques ou de dommages au fuseau conduisant à la formation de micronoyaux dans les érythrocytes immatures de l’espèce testée.

La probabilité que la substance testée ou ses métabolites atteignent la circulation générale ou spécifiquement le tissu cible (par exemple, toxicité systémique) doit être discutée. La démonstration d’une exposition adéquate du tissu cible dans un essai négatif du micronoyau est une considération particulièrement importante lorsqu’il existe des preuves positives de génotoxicité dans un ou plusieurs autres systèmes d’essai.

C. Rapport d’essai

Le rapport d’essai doit également comprendre les informations suivantes :

1. Substance d’essai

• données d’identification et n° CAS, s’il est connu
• nature physique et pureté
• propriétés physico-chimiques pertinentes pour la réalisation de l’étude
• stabilité de la substance d’essai, si elle est connue

2. Solvant/véhicule

• justification du choix du véhicule
• solubilité et stabilité de la substance à tester dans le solvant/véhicule, si elles sont connues

3. Solutions de dosage

• heures auxquelles les solutions de dosage ont été préparées et utilisées (ou intervalle entre la préparation et l’utilisation), et conditions de stockage
• données permettant de vérifier la concentration de la solution de dosage, si elles sont disponibles

4. Animaux d’essai

• espèces/souches utilisées, y compris la justification
• du nombre, de l’âge et du sexe des animaux
• source, conditions d’hébergement, régime alimentaire, etc.
• poids individuel des animaux au début de l’essai, y compris la fourchette de poids corporel, la moyenne et l’écart type pour chaque groupe
• information concernant l’influence potentielle de la sélection splénique sur l’incidence des cellules micronucléées dans le sang périphérique, le cas échéant

5. Conditions d’essai

• données de contrôle positives et négatives (véhicule/solvant)
• données de l’étude de détermination de la portée, si elle a été menée
• raisonnement pour la sélection du niveau de dose
• détails de la préparation de la substance d’essai
• détails de l’administration de la substance d’essai
• raisonnement pour la voie d’administration et le régime de dosage
• méthodes pour vérifier que la substance d’essai a atteint la circulation générale et/ou le tissu cible, le cas échéant
• conversion de la concentration de la substance d’essai dans le régime alimentaire/l’eau de boisson (ppm) à la dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour), le cas échéant
• détails de la qualité de l’alimentation et de l’eau
• description détaillée des programmes de traitement et d’échantillonnage
• méthodes de préparation des lames
• méthodes de mesure de la toxicité
• critères de notation des érythrocytes immatures micronucléés et, si approprié et applicable, les érythrocytes matures
• nombre de cellules analysées par animal
• critères pour considérer les études comme positives, négatives ou équivoques

6. Résultats

• signes de toxicité
• proportion d’érythrocytes immatures par rapport au total des érythrocytes
• nombre d’érythrocytes immatures micronucléés par rapport au total des érythrocytes immatures, donné séparément pour chaque animal
• si approprié et applicable, nombre d’érythrocytes matures micronucléés par rapport au total des érythrocytes matures, donné séparément pour chaque animal
• moyenne ± écart-type des érythrocytes immatures micronucléés et, le cas échéant, des érythrocytes matures par groupe
• relation dose-réponse, si possible
• analyses statistiques et justification de la méthode appliquée, avec citation appropriée de la littérature
• données de contrôle négatif concomitantes et historiques
• données de contrôle positif concomitantes et historiques

7. Discussion des résultats

8. Conclusion

XI. Addendum : Identification des micronoyaux dérivés de fragments acentriques par rapport aux chromosomes centromériques

Les micronoyaux peuvent être formés par des fragments acentriques ou des chromosomes entiers en retard dans la mitose. Ces derniers micronoyaux ont d’abord été reconnus par leur grande taille,(49) par le C-banding(47) ou par la mesure du contenu en ADN.(46) Cependant, ces méthodes n’étaient pas très fiables. Par conséquent, deux méthodes de cytogénétique moléculaire ont été développées pour identifier la présence de centromères dans les micronoyaux et ainsi différencier les micronoyaux d’origine clastogène et aneugénique :(12) 1) la coloration immunofluorescente CREST et 2) l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) avec des sondes ADN pancentromériques. Lorsqu’il est mécaniquement important de déterminer la présence du kinétochore ou du centromère dans les micronoyaux, ces méthodes peuvent être appliquées.

La méthode CREST appliquée au test du micronoyau de la moelle osseuse est décrite en détail par Miller et Adler.(33) Les cellules sur lames (frottis de moelle osseuse normale) sont fixées, déshydratées, incubées en deux étapes avec du SDS et du Triton-X, puis colorées avec un anticorps. L’ADN est contre-coloré par Hoechst 33258.

Avec la FISH, la sonde d’ADN satellite mineur qui s’hybride à proximité du centromère(43) est utilisée pour identifier la région centromérique, si elle est présente. Une méthode de FISH avec les sondes ADN centromériques a été décrite par Pinkel et al.(34) Cette méthode peut être appliquée à des érythrocytes contenant des micronoyaux triés par flux.(10) ou à des micronoyaux isolés obtenus à partir d’échantillons de sang périphérique.(13)

Dans les lames témoins, le taux de micronoyaux marqués contenant la région centromérique est d’environ 50 %.(43) Environ 70 % des micronoyaux induits par des aneugènes connus (colchicine et vinblastine) sont marqués,(33) alors que ceux induits par des clastogènes (hydroquinone et mitomycine C) ne présentent que 5 à 15 % de micronoyaux marqués.(33) Pour caractériser l’activité clastogène vs aneugène relative d’un produit chimique, il est utile d’utiliser comme indice le nombre d’érythrocytes polychromatiques micronucléés pour 1000 érythrocytes polychromatiques qui contiennent la région centromérique.(42)

La principale déficience des méthodes FISH décrites à ce jour est qu’elles ne font pas la différence entre les érythrocytes normochromatiques et polychromatiques.(12) Ainsi, seules les préparations dans lesquelles une grande partie des micronoyaux présents sont induits par l’article d’essai peuvent être analysées. Par exemple, les échantillons de sang périphérique provenant d’expériences d’expositions aiguës chez des animaux adultes ne conviennent essentiellement jamais à l’analyse car la population cellulaire cible (érythrocytes immatures) ne représente que 3 à 5 % des érythrocytes de l’échantillon.

En conclusion, les marquages CREST ou FISH sont considérés comme des méthodes fiables pour détecter les propriétés aneugéniques des produits chimiques dans le test du micronoyau in vivo, à condition de veiller à ce que les échantillons appropriés soient utilisés pour l’analyse.(12) Cependant, la complexité des méthodes actuelles limite leur utilisation aux cas où un produit chimique est suspecté de provoquer une altération du fuseau (par ex, en raison de la présence de grands micronoyaux, de l’induction de la polyploïdie, etc.) ou lorsqu’il existe d’autres raisons spécifiques d’obtenir ces informations mécanistiques.

X. Références

1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). Micronuclei Induced in Peripheral Blood of mu-PIM-1 Transgenic Mice by Chronic Oral Treatment with 2-Acetylaminofluorene or Benzene but not with Diethylnitrosamine or 1,2-Dichloroethane. Mutation Res. 302:61-70.
2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Induction of Micronuclei by Benzene in B6C3F1 Mice : Retrospective Analysis of Peripheral Blood Smears from the NTP Carcinogenesis Bioassay. Mutation Res. 143:55-59.
3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. et Book, S.A. (1989). Primate Micronucleus Study of L-Selenomethionine. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Test du micronoyau avec des érythrocytes de sang périphérique de souris par coloration supravitale à l’orange acridine : The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocole recommandé pour le test à court terme du micronoyau dans le sang périphérique de la souris. Mutagenesis 10:153-159.
6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. et MacGregor, J.T. (1988). Association of Marginal Folate Depletion with Increased Human Chromosomal Damage In Vivo : Demonstration by Analysis of Micronucleated Erythrocytes. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J., et Richold, M. (1992). Rapport du groupe de travail de la British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society : Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). The In Vivo Rat Micronucleus Test : Integration with a 14-Day Study. Mutation Res. 342:71-6.
9. Gollapudi, B. et McFadden, L.G. (1995). Taille de l’échantillon pour l’estimation du rapport entre les érythrocytes polychromatiques et normochromatiques dans le test du micronoyau de la moelle osseuse. Mutation Res. 347:97-99).
10. Grawé J., Nüsse M. et Adler I.-D.. (1997). Études quantitatives et qualitatives de l’induction du micronoyau dans les érythrocytes de souris en utilisant la cytométrie en flux : I. Measurement of Micronucleus Induction in Peripheral Blood Polychromatic Erythrocytes by Chemicals with Known and Suspected Genotoxicity. Mutagenèse 12:1-8.
11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). Evaluation of the Rodent Long-Term Micronucleus Assay : Summary of the 13th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. et Sutou, S. (2000). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay : II. Some Aspects of Protocol Design Including Repeated Treates, Integration with Toxicity Testing, and Automated Scoring. Environ. Molec. Mutagenesis 35 : 234-252.
13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Isolation of Micronuclei from Mouse Blood, Fluorescence In Situ Hybridization with a Mouse Centromeric DNA-Probe. Mutation Res. 307:245-251.
14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., et Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Research 245:245-249.
15. Hayashi, M., Sofuni, T., et Ishidate, M. Jr. (1983). Une application de la coloration fluorescente à l’orange acridine au test du micronoyau. Mutation Res. 120:241-247.
16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. et Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res. 312:293-304.
17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. et Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123:61-118.
19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Induction of Micronuclei in Rat Bone Marrow and Peripheral Blood Following Acute and Subchronic Treatment with Azathioprine. Mutation Res. 291:79-85.
20. Higashikuni, N. et Sutou, S. (1995). Un temps d’échantillonnage optimal et généralisé de 30 ±6 h après une double dose dans le test du micronoyau du sang périphérique de la souris. Mutagenesis 10:313-319.
21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadiène : Induction of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Blood of B6C3F1 Mice Exposed by Inhalation for 13 Weeks. Mutation Res. 209:171-176.
22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). Validation de l’évaluation du micronoyau chez le rat en utilisant la cytométrie de flux avec cinq composés modèles. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). Principes et pratiques d’intégration de l’évaluation de la génotoxicité dans les études toxicologiques de routine : A Pharmaceutical Industry Perspective. Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. et Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In : D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney pp. 184-232.
25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). The Effect of Exposure Regimen and Duration on Benzene-Induced Bone-Marrow Damage in Mice. I. Sex Comparison in DBA/2 Mice. Mutation Res. 203:251-271.
26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. et Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., et Wehr, C.M. (1983). Micronuclei dans les érythrocytes circulants : A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in : « Developments in Science and Practice of Toxicology », Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell et T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. et Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes : The Basis of an Improved Micronucleus Test. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., et Shelby, M.E. (1990). The In Vivo Erythrocyte Micronucleus Test : Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fonds. Appl. Toxicol. 14:513-522.
30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., et Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
31. Matter, B.E. and Schmid, W. (1971). Dommages chromosomiques induits par le trenimon dans les cellules de la moelle osseuse de six espèces de mammifères. Mutation Res. 12:417-425.
32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. et Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 239:29-80.
33. Miller B.M. et Adler I.-D.. (1990). Application de la coloration par anticorps antikinetochore (coloration CREST) aux micronoyaux dans les érythrocytes induits in vivo. Mutagenèse 5:411-415.
34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Analyse cytogénétique utilisant l’hybridation quantitative de fluorescence à haute sensibilité. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2934-2938.
35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. et Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In : D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
36. Romagna, F. et Staniforth , C.D.(1989). The Automated Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 213:91-104
37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). Un dépistage rapide des dommages chromosomiques cumulatifs chez les souris. Accumulation d’érythrocytes micronucléés circulants. Mutation Res. 113:481-487.
38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). La persistance des micronoyaux dans les érythrocytes du sang périphérique : Detection of Chronic Chromosome Breakage in Mice. Mutatation Res. 104:367-369.
39. Schlegel, R. et MacGregor, J.T. (1984). La persistance d’érythrocytes micronucléés dans la circulation périphérique de rats Fischer 344 normaux et splénectomisés : Implications for Cytogenetic Screening. Mutation Res. 127:169-174.
40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. et Everson, R.B. (1986). Évaluation des dommages cytogénétiques par la quantification des micronuclei dans les érythrocytes du sang périphérique humain. Cancer Res. 46:3717-3721.
41. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test. Mutation Res. 31:9-15.
42. Schriever-Schwemmer G. et Adler I.-D.. (1997). Différenciation des micronoyaux dans les cellules de moelle osseuse de souris : A Comparison between CREST Staining and Fluorescence In Situ Hybridization with Centromeric and Telomeric DNA Probes. Mutagenèse 9:333-340.
43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U., and Adler I.-D.. (1994). Extruded Micronuclei Induced by Colchicine or Acrylamide Containly Lagging Chromosomes Identified in Paintbrush Smears by Minor and Major Mouse DNA Probes. Mutagenèse 12:201-207.
44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). Measurement of Micronucleated Erythrocytes and DNA Damage During Chronic Ingestion of Phenolphthalein in Transgenic Female Mice Heterozygous for the p53 Gene. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
45. Tsuchimoto, T. et Matter, B.E. (1979). Méthodes de dépistage cytogénétique in vivo des mutagènes, avec une référence particulière au test du micronoyau. Arch. Toxicol. 42:239-248.
46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L., et Kirsch-Volders M. (1989). The Mouse Bone Marrow Micronucleus Assay Can be Used to Distinguish Aneugens from Clastogens. Mutagenesis 4:6-11.
47. Verschaeve L., Vanderkerken K., and Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Stain Technol. 63:351-354.
48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Phénolphtaléine : Induction of Micronucleated Erythrocytes in Mice. Mutation Res. 341:151-60.
49. Yamamoto K.I. et Kikuchi Y.. (1980). Une comparaison des diamètres des micronoyaux induits par les clastogènes et par les poisons du fuseau. Mutation Res. 71:127-131.
50. Yamamoto K.I. et Kikuchi Y. (1981). Studies on Micronuclei Time Response and on the Effects of Multiple Treatments of Mutagens on Induction of Micronuclei. Mutation Res. 90:163-173.