Un hydrogel d’ADN produisant de l’ARN comme plateforme pour un système d’interférence ARN haute performance

Synthèse et caractérisation de l’I-gel

Les quatre oligonucléotides d’ADN-X (brins d’ADN X01-X04) ont été synthétisés commercialement par Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). Les séquences d’ADN-X (tableau supplémentaire 5) ont été conçues, préparées et caractérisées en suivant les mêmes procédures que celles décrites dans la littérature avec de légères modifications10,13. Les brins d’ADN lyophilisés à l’échelle de 1 μmol ont été recueillis par centrifugation à 14 000 g pendant 15 s à température ambiante. Chaque brin d’ADN a été remis en suspension à une concentration de 1,0 mM dans un tampon TE 1x (pH 8,0). Chaque tube a été agité et mélangé à l’aide de MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) à 1500 rpm pendant ~3 h pour dissoudre complètement les oligonucléotides lyophilisés. Au total, 0,05 μmol (50 μl) de chaque brin d’ADN a été combiné à un tube de 1,5 ml, et de l’eau sans nucléase a été ajoutée, le volume total du mélange d’oligonucléotides atteignant 500 μl. 100 μl du mélange d’oligonucléotides ont été répartis dans des tubes de 0,5 ml. Les tubes ont été placés dans un thermocycleur (Bio-Rad, CA, USA). Les quatre types d’oligonucléotides (X01 ~04) ont été recuits dans les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min ; et 65 °C pendant 2 min, 60 °C pendant 5,5 min, diminution de 1 °C en maintenant 1 min à cette température, 20 °C pendant 30 s, et diminution à 4 °C pour la stabilisation et le stockage de l’ADN-X. Ensuite, pour l’échange de tampon, la solution d’ADN-X recuit (500 μl) dans une unité de filtration (seuil de Mw de 3 kDa) pour microcentrifugation a été centrifugée pendant 6 h à 15 000 g et 4 °C pour réduire le volume de solvant. L’unité de filtration a été transférée dans un tube de centrifugation frais. Au total, 100 μl d’eau exempte de nucléase à 4 °C environ ont été ajoutés à l’unité de filtration. L’unité de filtration a été centrifugée pendant 4 h à 15 000 g et 4 °C pour rincer l’ADN X des sels restants. Le module de filtre de coupure doit être placé à l’envers dans le tube et centrifugé à 2000 g pendant 3 min à 4 °C. L’ajout d’eau exempte de nucléase et la centrifugation ont été effectués deux fois de plus en utilisant le même tube de centrifugation pour éliminer complètement les sels résiduels de l’ADN X. Le volume final de la solution d’ADN-X sera de ~300 μl. Le plasmide d’expression du siRNA (I-plasmide) a été acheté et maxi préparé par Cosmo Genetech (Séoul, Corée du Sud). Pour construire les I-gels, les I-plasmides ont été linéarisés en utilisant l’enzyme de restriction BamHI. La taille du gène du siRNA était de 66 pb avec l’espaceur (ou 498 pb avec le promoteur T7) (voir la figure supplémentaire 4 pour la carte des plasmides I). Les quantités d’ADN des échantillons ont été déterminées à partir de leur valeur d’absorption UV/Vis en utilisant un BioSpectromètre (Eppendorf, Hambourg, Allemagne). L’ADN-X et les plasmides linéaires ont d’abord été mélangés à un rapport molaire prédéterminé en présence d’ADN ligase T4 (Promega, Madison, WI, USA) pour synthétiser le Dgel. Pour un ratio X-ADN:I-plasmide de 1500:1, nous avons utilisé 10,5 μL de 75 μM de X-ADN et 5,25 μL de 100 nM de plasmide dans un volume réactionnel de 30 μL. Pour l’expérience du gel blanc, la même quantité de matériel X-ADN que dans le gel I a été ligaturée avec de l’ADN ligase T4. 10 µL de chaque échantillon ont été mélangés avec 2 µL de tampon de chargement de gel et électrophorèse sur un gel d’agarose à 0,7 ou 2% à 100 V pendant 60 min. Tous les ADN (ADN-X, plasmide I, gel blanc et gel I) ont été confirmés par électrophorèse sur gel d’agarose (Figures supplémentaires 3, 11, 18). Les Dgels synthétisés ont été dessalés deux fois en utilisant des filtres centrifuges microtubulaires Amicon à seuil de coupure de 3 kDa Mw. Pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage (MEB), les échantillons ont été lyophilisés dans un lyophilisateur FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) jusqu’à ce que toute l’eau ait été éliminée. Les échantillons séchés ont été craqués pour révéler leurs surfaces fraîches. Après avoir été recouverts par pulvérisation cathodique d’une couche de Pt de 2~ 3 nm pendant 100 s, les morphologies de ces surfaces d’hydrogel ont été observées à un grossissement de ~50 000× à l’aide d’un microscope électronique à balayage S-3500N (Hitachi, Tokyo, Japon) à une tension d’accélération de 15 kV (figure supplémentaire 19).

Test de stabilité de l’I-gel

Sept échantillons ont été préparés pour chacun du plasmide I libre et de l’I-gel. Dans chaque échantillon, 2 µL du I-plasmide libre (57 ng) ou de l’I-gel (gel 1:1500 contenant 57 ng de I-plasmide) ont été dilués dans 12 µL d’eau distillée puis 4 µL de tampon 5 × optimisé pour la transcription ont été ajoutés et traités avec 3,33 × 10-5 unités de DNase I (n° M6101 ; Promega) à 20 µL de volume final, suivis d’une incubation à 37 °C pendant 0, 1, 4, 12, 24 et 48 h, respectivement. Après incubation, les échantillons de 20 µL ont été séparés en deux aliquotes de 10 µL, l’un pour l’électrophorèse et l’autre pour la transcription suivante. Dans chacune des aliquotes, la réaction de dénaturation a été arrêtée par l’ajout de 1 µL de solution d’arrêt de la DNase RQ1 et une incubation de 10 min à 65 °C. Ensuite, 10 µL de chaque échantillon ont été mélangés avec 2 µL de tampon de chargement de gel et électrophorèse sur un gel d’agarose à 2% à 100 V pendant 60 min (Figure supplémentaire 13). Une autre aliquote de chaque échantillon a été utilisée pour la réaction de transcription afin de démontrer l’efficacité de la transcription de l’I-gel après la réaction de digestion. Les shRNA ont été transcrits à partir de l’I-gel ou des gabarits de plasmides I libres (0, 24, 48 h) en utilisant le kit de transcription (Riboprobe ; Promega) en suivant les instructions du fabricant. Les shRNA obtenus ont été quantifiés par RT-qPCR comme décrit dans les sections Préparation de l’ARN total et transcription inverse et PCR en temps réel et analyse des données (tableau supplémentaire 4).

Analyses d’expression et d’inhibition des protéines

Les kits de transcription et de traduction couplés (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, n° de catalogue 88882) ont été achetés chez Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), et les réactions ont été réalisées en suivant les procédures suggérées par le fabricant. En bref, le lysat de cellules HeLa, les protéines accessoires, le mélange réactionnel et le plasmide pcDNA3.1( + ) IRES GFP (0,5 μg/μL ; n° 51406 ; Addgene, Cambridge, MA, États-Unis) ont été mélangés dans un mélange 12,5:2.5:5:2 (v/v) et incubées à 30 °C pendant 1, 2, 4 et 6 h. Après les temps de réaction indiqués, les solutions d’échantillons ont été incubées pendant 24 h à 4 °C pour à la fois arrêter la réaction et garantir un temps de repliement suffisant des protéines. Pour évaluer l’efficacité de l’interférence, le plasmide I ou le gel I libre a été ajouté au lysat cellulaire en présence de 1000 ng de plasmide GFP. Dans les expériences de contrôle pour la condition I-gel optimisée contenant 57 ng de I-plasmide (17,5 nmol), shRNA brouillé (17,5 nmol et 1,75 μmol ; 1 eq et 100 eq à la quantité de I-plasmide, respectivement) (SN-1003 ; Bioneer, Séoul, Corée), mélange de plasmide brouillé (17.5 nmol ; mélange de plasmides d’expression shRNA brouillés ; Cosmo Genetech), le gel de plasmides brouillés (mélange de plasmides brouillés réticulé enzymatiquement avec de l’ADN-X), le composant I-gel (ADN-X uniquement, plasmide I uniquement, ou ces mélanges sans réticulation enzymatique ; c’est-à-dire sans formation de gel), ou le gel blanc (réticulation enzymatique des ADN-X uniquement) ont été ajoutés directement à la solution réactionnelle d’expression de la GFP. Toutes les réactions ont été réalisées au moins trois fois. Sauf indication contraire, le volume de réaction a été maintenu à 25 μL. Les spectres de fluorescence ont été analysés à l’aide d’un spectrofluorophotomètre (FluoroMate FS-2 ; SCINCO Co., Ltd, Séoul, Corée) pour déterminer le niveau d’expression de la GFP dans la solution de lysat cellulaire.

Préparation de l’ARN total et transcription inverse

Comme contrôle de pointe, 3 µL de cel-miR-39 (33 fmol/µL ; n° 59000 ; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canada) ont été ajoutés à tous les lysats cellulaires pré-exprimés (20 µL) avant l’extraction de l’ARN. Ensuite, l’ARN total a été extrait de 23 µL du lysat en utilisant le réactif TRIzol (Ambion, Thermo Fisher Scientific) selon les instructions du fabricant. L’ARN total extrait a été dissous dans 10 µL d’eau traitée au DEPC (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Ensuite, 2 µL d’ARN total ont été polyadénylés avec 1 mM d’ATP dans 1 × tampon poly(A) polymérase contenant 5 U de poly(A) polymérase d’Escherichia coli (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) à 37 °C pendant 30 min dans un mélange réactionnel de 20 µL. Pour la transcription inverse, 4 µL de l’ARN écorché ont été mélangés avec 1 pmol d’amorce RT et un mélange de dNTP 0,5 mM, puis portés à un volume de 13 µL avec de l’eau traitée au DEPC. Le mélange a été chauffé à 65 °C pendant 5 minutes, puis rapidement refroidi sur glace. Le mélange réactionnel a ensuite été porté à un volume final de 20 µL par l’ajout de 5 mM de dithiothréitol, 1 × tampon premier brin, 40 U d’inhibiteur de RNase et 200 U de transcriptase inverse SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et incubé à 50 °C pendant 1 h, suivi d’une inactivation enzymatique à 70 °C pendant 15 min. Les séquences d’amorces RT (voir tableau supplémentaire 5) ont été conçues pour la synthèse d’ADNc à partir de la séquence d’ARN. L’amorce utilisée était l’adaptateur 3′ RACE, qui est fourni dans le kit FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Toutes les amorces ont été synthétisées par Cosmo Genetech, sauf l’amorce avant cel-miR-39 (Norgen Biotek Corp.). Le taux de récupération de l’ARN dans chaque solution de lysat a été estimé à partir de la différence entre la valeur CT du contrôle spike-in obtenu et celle de la référence cel-miR-39 (n’ayant pas procédé au processus d’extraction).

PCR en temps réel et analyse des données

Les quantités de shRNA et d’ARNm GFP ont été quantifiées par qPCR à l’aide du système StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La qPCR de chaque échantillon a été réalisée dans un volume total de 20 µl avec 2 µl d’ADNc, 10 µl de 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific), et 10 pmol de chaque amorce. L’amplification a été réalisée dans les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 minutes ; et 30 cycles de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s. La qPCR a également été réalisée avec le cel-miR-39 comme ARN de référence pour obtenir le taux de récupération de l’ARN total dans chaque échantillon. Le protocole de qPCR était le même que celui décrit ci-dessus dans cette section, à l’exception des amorces utilisées, qui étaient 10 pmol d’une amorce inverse commune (la même que l’amorce inverse shRNA) et d’une amorce directe cel-miR-39. La courbe de fusion de chaque produit d’ADN amplifié a été obtenue en mesurant le changement d’intensité de la fluorescence du colorant SYBR Green six fois par échantillon tout en augmentant la température de 60 °C à 95 °C à une vitesse de + 0,3 °C/s après l’achèvement de la qPCR. Les amorces spécifiques pour la qPCR ont été conçues à l’aide du programme Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (tableau supplémentaire 5). L’expression relative des cibles a été déterminée en utilisant la méthode comparative 2-ΔΔCT. La quantité relative de l’ARNm de la GFP a également été confirmée par la mesure de l’intensité de la bande sur le gel d’agarose à 2 %. L’amplification de l’ADNc a été réalisée avec les mêmes conditions et le même programme PCR que ceux utilisés pour la qPCR décrite ci-dessus, à l’exception du nombre de cycles PCR (20 pour l’ARNm GFP).

Calibration et quantification de la quantité absolue d’ARN

Des courbes standard pour la concentration d’ARN et la valeur CT ont été obtenues en utilisant chaque matériau standard d’ARN. Pour le shRNA, la courbe standard a été obtenue en utilisant des shRNA synthétisés achetés chez Integrated DNA Technologies. Pour l’ARNm GFP, la courbe a été obtenue en utilisant l’ARNm GFP extrait d’un kit de transcription (Riboprobe ; Promega) selon les instructions du fabricant. La quantité d’ARN du shRNA standard a été renseignée par Integrated DNA Technologies, tandis que celle de l’ARNm GFP standard extrait a été déterminée à partir de sa valeur d’absorption UV/Vis à l’aide du BioSpectromètre. Les ARN standard obtenus ont été convertis en ADNc par transcription inverse, comme décrit ci-dessus dans la section « Préparation de l’ARN total et transcription inverse ». Ensuite, l’ADNc a été dilué 10, 100, 1000 et 10 000 fois, puis la qPCR a été répétée trois fois, et les valeurs CT obtenues ont été utilisées pour obtenir une courbe standard. Les valeurs CT obtenues à partir de la RT-qPCR ont été converties en concentrations initiales d’ARN dans les lysats cellulaires par un processus d’étalonnage (figure supplémentaire 6). La quantité absolue finale d’ARN a été déterminée en multipliant chaque taux de récupération d’ARN (%) et la valeur de la quantité d’ARN de la courbe d’étalonnage (tableaux supplémentaires 1, 2).

Marquage cellulaire avec Cy5-I-gel

Les cellules de rein canin Madin-Darby (MDCK) ont été obtenues auprès de la banque de lignées cellulaires de Corée (Séoul, Corée) et maintenues dans du DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur humidifié et maintenu en CO2 (5 %). Les cellules MDCK exprimant la GFP (MDCK-GFP) ont été préparées en transfectant le vecteur pEGFP-N1 dans les cellules à l’aide des réactifs Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific) selon le protocole du fabricant. Ensuite, nous avons trié les cellules émettant la GFP à l’aide du système FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Tout au long de la recherche, les cellules ont été testées négatives pour la contamination par les mycoplasmes. Les cellules MDCK-GFP cultivées dans des plaques à 24 puits avec des lamelles couvre-objet (50 000 cellules par puits) ont été mises en coexistence avec le gel Cy5-I (Cy5-conjugué I-gel) contenant des brins de séquence d’ADN X01 conjugués au Cy5 (correspondant à 2,625 μM d’ADN X ; Integrated DNA Technologies) dans un milieu sans sérum pendant 4 heures. Pour préparer le plasmide Cy5-I, le Cy5-dsDNA (dsDNA conjugué à Cy5) a d’abord été préparé par l’annexion de X01 conjugué à Cy5 (avec une extrémité collante 5′-p-GATC supplémentaire) et de son contre-brin complémentaire (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Ensuite, l’ADN-ds Cy5 et le plasmide I ont été mélangés et ligaturés à un rapport molaire de 5000:1. L’excès de Cy5-ADNdc non lié a été éliminé par centrifugation (12 400 g, 4 °C, 60 min) à l’aide de filtres centrifuges microtubulaires Amicon (50 kDa Mw cutoff) pendant 4 à 5 fois. Le Cy5-shRNA (shRNA conjugué à Cy5) a été synthétisé commercialement (Integrated DNA Technologies). Pour les ensembles Cy5-I-plasmide et Cy5-shRNA, les cellules ont coïncidé avec 2,625 nM de chaque échantillon dans un milieu sans sérum pendant 4 h. Pour les ensembles Lipofectamine-Cy5-I-plasmide et Lipofectamine-Cy5-shRNA, la Lipofectamine et l’échantillon conjugué au Cy5 ont été complexés électrostatiquement en les mélangeant dans un rapport molaire de 1:1 jusqu’à une concentration finale de la solution de 2,625 μM de Lipofectamine et 2,625 μM de substrat. Ensuite, les cellules ont coexisté avec les 2,625 μM de Lipofectamine-Cy5-I-plasmide ou de Lipofectamine-Cy5-shRNA dans un milieu sans sérum pendant 4 h, respectivement. Dans le cas du contrôle uniquement cellulaire, les cellules ont coexisté avec du DMEM sans sérum contenant 1 % (v/v) de pénicilline (HyClone). Après 4 h de coïncubation, tous les échantillons ont été lavés deux fois avec du tampon phosphate-buffered saline (PBS) (0,1 M, pH 7,4) et les cellules ont ensuite été incubées pendant 6 h dans un milieu de croissance contenant 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS ; HyClone) et 1 % de pénicilline pour garantir un temps de récupération et d’absorption cellulaire suffisant. Les cellules cultivées ont été fixées avec du formaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante, puis lavées trois fois avec du tampon PBS (0,1 M, pH 7,4). Pour l’imagerie au microscope, les lamelles couvre-objet avec les cellules attachées ont été montées sur des lames de verre en utilisant un milieu de montage aqueux avec un agent antifading. Les images de fluorescence ont été enregistrées à l’aide d’un microscope Zeiss Axioplan 2, et les photos ont été prises à l’aide d’une caméra Zeiss Axiocam HR.

Expérience de silençage du gène GFP à l’aide du I-gel

D’abord, le I-gel contenant 262,5 µM d’ADN-X et 175 nM de plasmide I a été incubé avec 300 U d’ARN polymérase T7 (Thermo Fisher Scientific) pendant 15 min à température ambiante. Après l’incubation, l’échantillon I-gel a été dilué à 100 fois dans du DMEM sans sérum contenant 1% de pénicilline. Ensuite, 1/6 du volume du complexe I-gel/polymérase a été ajouté à chaque puits d’une plaque de 24 puits avec lamelle couvre-objet qui avait été préplanté avec des cellules MDCK-GFP (20 000 cellules par puits) pendant 24 h. Pour les ensembles de gel I-plasmide, mélange de plasmides brouillés et plasmides brouillés, les cellules MDCK-GFP ont été cocultivées avec la même quantité molaire de chaque plasmide et de l’ARN polymérase T7 que dans le cas du I-gel. Pour mesurer l’effet ARNi du shRNA nu et du Lipofectamine-shRNA, on a utilisé 100 fois plus de chaque échantillon d’ARN par rapport au nombre de gabarits de plasmides I, en tenant compte du taux d’expression du shRNA du gel I calculé à partir de l’expérience du lysat cellulaire. Pour les ensembles shRNA nus et shRNA brouillés, les cellules MDCK-GFP ont coexisté avec 175 nM de l’échantillon d’ARN. Les échantillons complexés à la lipofectamine ont été préparés selon les instructions du fabricant. Pour les ensembles de mélange Lipofectamine-I-plasmide et Lipofectamine-plasmide brouillé, la Lipofectamine et chaque échantillon de plasmide ont été complexés électrostatiquement en les mélangeant dans un rapport molaire de 5:1 pour obtenir une concentration finale de solution de 8,75 nM de Lipofectamine et 1,75 nM de substrat de plasmide. Pour l’ensemble Lipofectamine-shRNA, la Lipofectamine et le shRNA libre ont été complexés électrostatiquement en les mélangeant dans un rapport molaire de 5:1 pour obtenir une concentration finale de la solution de 875 nM de Lipofectamine et 175 nM de shRNA. Les cellules MDCK-GFP ont été incubées avec les échantillons complexés à la Lipofectamine tels que préparés dans un milieu sans sérum pendant 4 h. Pour l’ensemble de cellules seulement, seules les cellules MDCK-GFP ont été incubées dans le milieu sans sérum pendant 4 h, sans aucun échantillon. Tous les échantillons ont été lavés après la période de coïncubation de 4 h, et les cellules ont été incubées pendant 48 h avec le milieu de croissance (DMEM contenant 10 % (v/s) de FBS et 1 % de pénicilline) pour évaluer l’effet de silençage de l’ARN à 37 °C sous 5 % de CO2. Les cellules ont ensuite été fixées avec du formaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante et lavées avec du tampon PBS (0,1 M, pH 7,4). Pour l’imagerie au microscope, les cellules fixées sur une lamelle couvre-objet ont été montées sur des lames de verre à l’aide d’un milieu de montage aqueux avec un agent antifading.

Analyse de l’expression génique par PCR quantitative dans des cellules vivantes

Tous les échantillons ont été traités à et incubés dans chaque milieu cellulaire à la même quantité et dans les mêmes conditions que celles utilisées dans l’expérience de silençage du gène GFP décrite précédemment en utilisant la section I-gel. Après incubation, le milieu cellulaire a été aspiré des plaques de culture cellulaire, et les cellules MDCK-GFP ont été lavées une fois avec du tampon PBS et trypsinées pour détacher les cellules dans chaque puits de la plaque. Les cellules détachées ont été diluées avec du tampon PBS pour désactiver la trypsine, puis elles ont été recueillies dans un microtube de 1,5 ml et pelletées par centrifugation (180 g, 5 min). Le surnageant a été retiré et les cellules ont été diluées avec 20 µL de tampon PBS. La solution de suspension cellulaire (20 µL) a été traitée avec 1 mL de réactif TRIzol, 3 µL de cel-miR-39 (33 fmol/µL), et 200 µL de solution de chloroforme. L’extraction ultérieure de l’ARN a été effectuée selon les instructions du fabricant. Pour quantifier la quantité relative d’ARNm GFP et d’ARNsh au niveau cellulaire, toutes les qPCR des préparations d’échantillons ont été réalisées selon la même méthode décrite dans les sections « Préparation de l’ARN total et transcription inverse » et « PCR en temps réel et analyse des données ».

Analyse de l’imagerie cellulaire pour la quantification de l’intensité des pixels

Par traitement de l’image cellulaire, les données ont été réalisées à l’aide du programme MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). Les images de fluorescence brutes ont été importées dans MATLAB, et chaque pixel des images a été converti en chaque composant de la matrice. La distribution des intensités de fluorescence de chaque composant a été représentée graphiquement par un histogramme. L’ensemble des données a été divisé en 256 intervalles.

Analyse de tri cellulaire activé par fluorescence

Les cellules ont été lavées une fois avec 1 ml de PBS, puis le milieu de croissance a été aspiré des plaques de culture cellulaire. Ensuite, les cellules ont été détachées de la plaque par traitement à la trypsine. Les cellules détachées ont été recueillies dans un tube de 15 ml, puis centrifugées pour obtenir un culot (180 g, 3 min). La solution de trypsine surnageante a été éliminée et le culot cellulaire a été lavé deux fois avec 2 ml de PBS. Les cellules ont été remises en suspension dans du PBS pour obtenir une concentration de 50 000 cellules/mL. Ensuite, les échantillons ont été préparés en fixant les cellules dans une solution de formaldéhyde à 1% pendant 10 minutes à température ambiante. Les échantillons ont été analysés pour l’intensité de la fluorescence de la GFP en utilisant le système FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Niveaux de viabilité relative à l’obscurité

Une suspension de cellules MDCK-GFP (5000 cellules par puits) a été distribuée dans une plaque à 96 puits (Corning Inc, Corning, NY, USA) et incubée pendant 1 jour à 37 °C sous 5% de CO2. Une fois que les cellules se sont attachées à la plaque, elles ont été mises en coexistence avec différentes concentrations de l’I-gel (correspondant à la concentration d’ADN X) dans le milieu de croissance (DMEM contenant 10% (v/v) de FBS et 1% de pénicilline) dans l’obscurité. L’I-gel était composé d’un rapport molaire X-ADN:I-plasmide de 1500:1. Ces échantillons ont été incubés pendant 6, 24 et 48 heures à 37 °C sous 5 % de CO2. À la fin de chaque temps d’incubation, la solution Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japon) a été ajoutée aux échantillons conformément aux instructions du fabricant. Après une nouvelle incubation de 1 h, l’absorbance à 450 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les résultats de cette mesure ont été exprimés sous forme de rapport entre l’absorbance de l’échantillon et celle des cellules témoins négatives sans incubation de l’échantillon.

Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée avec le logiciel Prism 7.05 (GraphPad Software) pour le test t de Student, l’ANOVA à sens unique avec post-test de Bonferroni pour les comparaisons multiples. Le post-test de comparaisons multiples de Holm-Bonferroni a été effectué en utilisant les résultats du post-test de comparaisons multiples de Bonferroni du logiciel Prism 7.05 (GraphPad Software)30. Le test de normalité a été calculé par le test de Shapiro-Wilk. Dans les résultats du test de Shapiro-Wilk, les données étaient approximativement distribuées normalement. La signification statistique est indiquée par *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.