Utilisation du polymère polyéthylèneimine en culture cellulaire comme facteur d’attachement et amplificateur de lipofection

L’IPE favorise l’attachement des cellules faiblement ancrées et des tissus primaires

Les cellules PC-12 sont utilisées comme modèle de différenciation neuronale en laboratoire, car le traitement de ces cellules par le facteur de croissance nerveuse (NGF) induit l’extension des neurites et l’expression de marqueurs biochimiques du phénotype neuronal sympathique . Elles se développent comme des cellules à faible ancrage et des polymères de collagène ou de polylysine sont fréquemment utilisés pour le pré-revêtement des plaques pour la culture des cellules PC-12 . Les cellules PC-12 ont été cultivées en laboratoire dans des puits naïfs ou dans des puits pré-revêtus de divers facteurs d’attachement (boîtes de culture tissulaire multipuits-12), afin d’observer l’effet sur l’ancrage des cellules au substrat. En l’absence de tout agent d’enrobage, les cellules ont montré une tendance caractéristique à former des amas de cellules qui s’accumulent vers le centre du puits ; ces cellules sont fermement attachées entre elles, mais très faiblement attachées à la boîte de culture de tissus (Figure 1D). Il en résulte une distribution très hétérogène des cellules (très peu de cellules restent vers le bord des puits) et une perte importante de cellules lors des procédures de lavage ou des changements de milieu. Le prétraitement des plaques avec du PEI a entraîné une distribution beaucoup plus homogène des cellules dans le puits, les cellules se fixant fermement à la plaque, montrant une tendance beaucoup plus faible à la formation de grappes (Figure 1A). À des fins de comparaison, les plaques ont également été prétraitées avec d’autres agents de revêtement couramment utilisés, le collagène (figure 1B) et la poly-D-Lysine (PDL ; figure 1C), ce qui a également entraîné une fixation plus ferme des cellules aux plaques et une distribution plus homogène des cellules.

Pour tester davantage la propriété d’amélioration de l’ancrage observée avec le prétraitement PEI des boîtes de culture, un deuxième système a été utilisé. Des explants rétiniens de poissons téléostéens ont été utilisés dans l’étude de la régénération nerveuse . Lorsqu’une lésion est appliquée au nerf optique du poisson, une réponse de régénération est initiée et les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) de la rétine rallongent leur axone vers le tissu cible tectal. Si la rétine d’un tel poisson « amorcé » est explantée et cultivée, la réponse de régénération est observée in vitro par l’extension accélérée de longs neurites. Cependant, ce phénomène nécessite l’utilisation d’une matrice extracellulaire ou de facteurs d’attachement (par exemple un revêtement de collagène ou de PDL), car les explants montrent une très faible affinité pour la surface plastique non revêtue. Des expériences ont été menées pour observer si le PEI pouvait agir comme un facteur d’attachement propice à la croissance axonale à partir d’explants rétiniens de poisson zèbre. Les explants rétiniens provenant d’yeux de poisson zèbre témoins ont pu se fixer sur des boîtes de culture traitées au PEI (figure 1E). De plus, les explants rétiniens provenant de poissons ayant reçu une lésion de conditionnement étaient capables d’étendre vigoureusement des axones lorsqu’ils étaient cultivés en utilisant le PEI comme facteur d’attachement (figure 1F).

Les résultats obtenus avec les explants rétiniens suggéraient que les cellules neuronales attachées aux plats recouverts de PEI peuvent se différencier, générant des neurites qui s’attachent bien au substrat. Pour tester cette hypothèse avec les cellules pro-neuronales PC-12, des expériences de différenciation par traitement au NGF ont été réalisées avec des cellules fixées sur des plats recouverts de PEI. Les cellules PC-12 traitées au NGF sont restées fermement attachées à la plaque pendant plusieurs jours, générant des réseaux de neurites (Figure 2). Les résultats indiquent que le PEI est permissif pour le processus de différenciation et pour l’attachement des neurites à la plaque. Les cellules différenciées sont restées fermement ancrées tout au long des expériences d’immunocytochimie (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García et R. P. Ballestero, résultats non publiés).

Force d’ancrage des cellules eucaryotes sur des boîtes de culture prétraitées avec du PEI et d’autres facteurs d’attachement

Trois lignées cellulaires différentes ont été sélectionnées pour tester la capacité du PEI à favoriser un ancrage fort sur des boîtes de culture en plastique. Les cellules PC-12 et HEK-293 ont été décrites ci-dessus comme étant faiblement ancrées. En revanche, les cellules MYS sont des fibroblastes primaires qui adhèrent fortement aux boîtes de culture en plastique, se développant pour former une monocouche de cellules à la surface. Pour tester la force de l’ancrage des diverses cellules aux plaques, un protocole a été réalisé dans lequel 4 lavages consécutifs avec un tampon isotonique ont été effectués, suivis par l’utilisation d’un protocole colorimétrique pour compter les cellules qui sont restées dans la plaque (basé sur le colorant vital rouge neutre). Les plaques prétraitées avec les divers facteurs d’attachement ont été comparées aux plaques qui n’ont reçu aucun prétraitement (non traitées). Les expériences ont été réalisées en trois exemplaires, et les moyennes de colorant retenu dans les plaques ayant reçu chaque traitement ont été calculées. Ces moyennes ont été normalisées par rapport à la moyenne obtenue avec le prétraitement à l’IPE, qui s’est vu attribuer la valeur arbitraire de 100,0 % dans toutes les expériences. Les résultats d’expériences représentatives avec les 3 lignées cellulaires sont présentés dans la figure 3 (au moins trois expériences indépendantes ont été réalisées avec chaque lignée cellulaire). Les cellules PC-12 se fixent presque aussi bien aux plaques recouvertes de PEI, de collagène ou de PDL (nombre relatif de cellules de 100,0 % ± 5,3 %, 89,3 % ± 5,0 % et 96,3 % ± 5,8 %, respectivement pour le PEI, le collagène et le PDL). Cependant, une perte significative de cellules a été observée en comparant les plaques non traitées avec les plaques prétraitées au PEI, avec un nombre relatif de cellules de 43,9 % ± 5,8 % (Figure 3A). Dans le cas des HEK-293, les cellules se sont fortement attachées aux puits traités au PEI et au PDL. Dans l’expérience représentative présentée à la figure 3B, les comptes relatifs avec ces deux traitements étaient respectivement de 100,0 % ± 0,4 % et 96,8 % ± 1,7 %. Cependant, un grand nombre de cellules ont été perdues lorsqu’elles ont été placées dans les puits non traités (compte relatif de 8,3 % ± 0,6 %) ou dans les puits prétraités au collagène (11,5 % ± 1,2 %), ce qui suggère que ces cellules se fixent de façon assez lâche au plastique ou aux puits recouverts de collagène. Enfin, lorsque les cellules de fibroblastes (cellules MYS) ont été utilisées, les cellules ont semblé se fixer assez bien sur les quatre surfaces, y compris sur les puits non traités (figure 3C). La figure 3C présente un graphique représentatif, montrant des numérations relatives de cellules MYS de 100,0 % ± 2,2 %, 85,9 % ± 7,8 %, 73,7 % ± 6,6 % et 77,1 % ± 1,4 %, avec des puits prétraités avec du PEI, du collagène ou du PDL, ou des puits non traités respectivement. Cette lignée cellulaire s’attache donc assez bien à la surface plastique non traitée comparativement aux lignées cellulaires PC-12 et HEK-293.

Pour donner une indication de la variation entre les expériences, les moyennes ± les écarts types des comptages cellulaires relatifs obtenus dans les expériences indépendantes ont été calculés pour chaque lignée cellulaire et chaque traitement (notez que puisque dans toutes les expériences, le comptage des puits prétraités au PEI a été fixé à 100,0 %, la valeur de la moyenne globale avec cet agent de revêtement est exactement de 100,0 % pour toutes les lignées cellulaires). Les résultats comparatifs pour les autres traitements sont indiqués ci-dessous. Pour les cellules PC-12, les comptes relatifs étaient de 81,5 % ± 8,8 % pour les puits traités au collagène (n = 4), 93,9 % ± 21,2 % pour les puits traités au PDL (n = 4) et 52,1 % ± 13,7 % pour les puits non traités (n = 4). Pour les cellules HEK-293, les comptes relatifs étaient de 16,3 % ± 12,7 % pour les puits prétraités au collagène (n = 3), 99,6 % ± 2,5 % pour les puits prétraités au PDL (n = 3) et 9,0 % ± 4,1 % pour les puits non traités (n = 3). Dans les expériences avec les cellules MYS, la moyenne des comptes relatifs avec les puits prétraités au collagène était de 92,7 % ± 16,2 % (n = 3), 71,1 % ± 6,7 % pour les puits prétraités au PDL (n = 3) et 78,4 % ± 11,5 % pour les puits non traités (n = 3). L’analyse statistique indique que l’amélioration de l’adhésion des cellules PC-12 et HEK-293 aux plats traités au PEI par rapport au plastique non traité est significative (p < 0,05 et p < 0,01 respectivement, analyse par test t), alors qu’elle n’est pas statistiquement significative pour les cellules MYS (p > 0,05).

Pour caractériser davantage les propriétés du PEI en tant que facteur d’attachement pour les cellules faiblement ancrées, des expériences ont été réalisées pour analyser le dosage de PEI qui peut fournir un ancrage cellulaire optimal, la gamme de nombres de cellules qui peuvent bénéficier de la présence de PEI, et la stabilité du PEI en tant que facteur d’attachement. La figure 4A montre les résultats d’une expérience représentative testant la force d’attachement de cellules HEK-293 à des plats recouverts de diverses doses de PEI. Le nombre de cellules a été normalisé par rapport à la valeur obtenue pour le traitement avec 25 μg/ml de PEI, qui a été fixée à 100,0 %. Les résultats indiquent que les concentrations de PEI de 2,5 μg/ml ou plus ont entraîné une amélioration maximale de l’attachement, ce qui suggère que la surface du plat en plastique est entièrement recouverte du polymère à ces concentrations. Les concentrations plus élevées du polymère ne semblaient pas avoir d’effets toxiques sur les cellules si l’excès de PEI restant dans la solution était soigneusement éliminé (de légers effets toxiques ont été observés à la concentration de 250 μg/ml si la solution n’était pas entièrement éliminée après le traitement). L’expérience présentée est représentative de 4 expériences indépendantes. La figure 4B représente les résultats obtenus avec différents nombres de cellules PC-12 et HEK-293. La figure montre les numérations cellulaires relatives, où une valeur arbitraire de 100,0 % a été attribuée à la numération moyenne obtenue à partir des puits traités à l’IPE avec le plus grand nombre de chaque lignée cellulaire (3,2 × 105 cellules HEK-293 et 1,5 × 106 cellules PC-12). Les résultats indiquent que le PEI a bien fonctionné comme facteur d’attachement dans une large gamme de nombres de cellules, tant pour les cellules PC-12 que pour les cellules HEK-293. Les nombres de cellules inférieurs n’ont pas pu être testés de manière fiable car ils étaient proches de la limite de sensibilité du test au rouge neutre. Les résultats présentés sont représentatifs d’au moins 4 expériences indépendantes réalisées avec chaque lignée cellulaire. La figure 4C montre les résultats d’une expérience menée pour tester la stabilité du PEI en tant que facteur d’attachement. Dans cette expérience, un ensemble de plaques a été traité avec du PEI et ensuite conservé dans du PBS à 4°C pendant 10 jours. Dans un second test, des plaques ont été traitées avec du PEI et conservées (avec du milieu) dans un incubateur CO2 à 37°C pendant 3 jours, avec un changement de milieu effectué toutes les 24 h. La performance du PEI dans ces plaques a ensuite été comparée à celle des plaques traitées avec du PEI en utilisant le protocole standard décrit pour les expériences précédentes. Les résultats montrent le nombre relatif de cellules normalisé par rapport à la moyenne des absorbances obtenues avec les plaques standard traitées au PEI, à laquelle on a attribué la valeur arbitraire de 100,0 %. Les résultats indiquent que le revêtement PEI reste stable sur la surface de la boîte en plastique pendant au moins 10 jours de réfrigération, et qu’il n’est pas éliminé par une incubation à 37°C dans le milieu ou même par des changements répétés de milieu. Les résultats sont représentatifs de 4 expériences indépendantes réalisées en triplicata.

Le prétraitement à l’IPE améliore la lipofection des cellules faiblement ancrées

La transfection de cellules eucaryotes par lipofection implique plusieurs étapes, des ajouts et des remplacements de milieux, qui peuvent faire des ravages dans les cellules faiblement ancrées. Même si l’on prend soin d’éviter la perte de cellules, les cellules faiblement ancrées peuvent être moins efficaces dans l’absorption des complexes de transfection. Étant donné que le prétraitement des boîtes de culture cellulaire à l’aide de PEI augmente la force d’attachement des cellules à ces surfaces, on a supposé que le facteur d’attachement pouvait avoir un effet positif sur les rendements de transfection obtenus par lipofection. Les trois lignées cellulaires décrites ci-dessus ont été utilisées pour tester cette hypothèse en utilisant les agents de revêtement examinés précédemment. Les transfections ont été réalisées avec un plasmide codant pour l’enzyme rapporteur β-galactosidase. Le rendement de la transfection a été contrôlé par la détermination de l’activité de l’enzyme rapporteur dans les lysats des cellules transfectées. Au moins deux essais indépendants en triplicata ont été réalisés avec chaque lignée cellulaire. Des graphiques représentatifs sont présentés dans la figure 5. Les rendements (activités β-galactosidase) ont été normalisés par rapport à l’activité obtenue avec le pré-enrobage PEI, qui a été fixé comme référence à 100,0 %. En général, on a observé que les rendements de transfection étaient améliorés dans les cellules faiblement ancrées par le pré-revêtement avec des agents qui favorisent l’attachement des cellules à la plaque. Dans le cas des cellules PC-12, le pré-revêtement des puits avec du PEI, du collagène ou du PDL a entraîné une augmentation de 2 à 3 fois du rendement de transfection par rapport aux puits non traités : rendements relatifs de 100,0 % ± 1,4 % pour le PEI, 87,0 % ± 8,7 % pour le collagène et 100,1 % ± 2,4 % pour le PDL, contre 42,9 % ± 2,2 % pour les puits non traités (figure 5A). L’amélioration du rendement de transfection par le prétraitement au PEI était plus prononcée pour les cellules HEK-293. L’expérience de la figure 5B montre une activité relative de 21,1 % ± 3,4 % pour les cellules dans les puits non traités, par rapport à 100,0 % ± 8,4 % pour les puits prétraités au PEI (environ 5 fois plus). Le prétraitement avec du collagène ou du PDL a entraîné des inductions plus modestes (environ 2 à 3 fois dans la figure 5B). L’amélioration la plus faible a été observée avec le collagène, de la même manière que l’amélioration plus faible de l’attachement des cellules HEK-293 qui a été précédemment observée dans la Figure 3B. Enfin, pour les fibroblastes MYS qui s’attachent fortement, aucun effet positif significatif n’a été observé en utilisant des facteurs d’attachement dans la procédure de transfection. Les variations étaient généralement inférieures à 20 % pour toutes les conditions expérimentales. L’expérience représentative présentée à la figure 5C montre en fait un rendement de transfection légèrement supérieur pour les puits non traités que pour les plaques prétraitées au PEI (activité relative de 117,7 % ± 3,2 % pour les puits non traités contre 100,0 % ± 4.8% pour les puits prétraités au PEI, soit un rendement de transfection environ 1,2 fois plus élevé dans le contrôle).

En compilant les résultats de toutes les expériences réalisées, la multiplication moyenne (± écart-type) observée dans le rendement de transfection des cellules PC-12 ancrées au PEI par rapport aux cellules sur des puits non traités était de 2.L’analyse statistique par test t indique que les deux augmentations sont significatives (p < 0,05). Aucune amélioration significative de la transfection n’a été observée dans les expériences avec les cellules MYS, avec un changement moyen de 1,0 fois (± 0,3 fois ; n = 2) par le prétraitement avec PEI (fondamentalement identique au rendement sans traitement).