Hmisen lysosomaalisen α-glukosidaasin rakenne – opas Pompe-taudin hoitoon

Rakenteellinen yleiskatsaus

GAA syntetisoituu 110 kDa:n glykoproteiinina, joka kohdistuu lysosomiin mannoosi-6-fosfaattireseptorin kautta ja käy läpi myöhäisessä endosomaalisessa/lyysosomaalisessa osastossa sarjan proteolyyttisiä ja N-glykaanin prosessointitapahtumia saadakseen kypsän aktiivisen muodon, joka koostuu neljästä tiiviisti assosioituneesta peptidistä19,20. Koska rhGAA:n kaupallisen Myozyme®-prekursorimuodon (Q57-C952) kiteyttäminen ei tuottanut yli ~7 Å:n diffraktiokiteitä ja koska proteiinien epäjärjestystä ennustavat ohjelmat21 viittasivat epäjärjestyneiden peptidialueiden olemassaoloon, suoritimme in situ-proteolyysin α-kymotrypsiinillä poistaaksemme mahdolliset joustavat pintasilmukat, jotka haittasivat tuottavien kiteiden kontaktien muodostumista. Proteolyyttinen käsittely tuotti polypeptidin, jonka massa oli ~5 kDa pienempi kuin rhGAA:n esiasteella (kuva 2a) ja joka kiteytyi helposti. Tämä mahdollisti 1,9 Å:iin ulottuvien diffraktiotietojen keräämisen ja rhGAA:n rakenteen ratkaisemisen molekyylikorvauksen avulla (taulukko 1). Proteolyyttisesti sulatetun muodon aktiivisuus oli verrattavissa esiasteen aktiivisuuteen (2,34 ± 0,06 U mg-1 esiasteelle ja 2,26 ± 0,16 U mg-1 kypsälle muodolle), mikä osoittaa, että α-kymotrypsiinikäsittely ei muuttanut rhGAA:n toimintaa.

RhGAA:n kiderakenne vastaa ihmisen istukan GAA:n kypsää muotoa ja rhGAA20:aa (kuva. 2b, mikä viittaa siihen, että käsittely α-kymotrypsiinillä mahdollisti proteaasilabiilien alueiden (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 ja A782-R794) poistamisen tavalla, joka on verrattavissa in vivo tapahtuvaan proteolyyttiseen kypsymiseen. rhGAA:n kokonaisarkkitehtuuri on samankaltainen kuin ihmisen glykosidihydrolaasiperheen GH311-homologeilla, suoliston harjanreunan entsyymeillä maltaasi-glukoamylaasilla (MGAM)22,23 ja sakkaraasi-isomaltaasilla (SI)24 (kuva 2c ja täydentävä kuva 1). N-terminaalista trefoil-tyypin P-domeenia seuraa β-lehtidomeeni, katalyyttinen (β/α)8 tynnyri, jossa on kaksi inserttiä β-säikeiden β3 (insertti I) ja β4 (insertti II) jälkeen, sekä proksimaaliset ja distaaliset β-lehtidomeenit C-terminaalissa. rhGAA:n esiaste sisältää ~14 kDa hiilihydraattia, ja seitsemän glykosylaatiokohtaa on ennustettu ja karakterisoitu20. Kiderakenteessa havaittiin eripituisia glykaanirakenteita viidelle niistä, erityisesti kohdissa N140, N233, N390, N470 ja N652 (kuva 2c ja täydentävä kuva 2). Havaitsimme N882:n kohdalla jäännöseron elektronitiheyden, joka ei riitä glykaanirakenteen mallintamiseen, emmekä havainneet eroa elektronitiheydessä lähellä N925:tä.

Aktiivinen paikka ja inhibiittorin sitoutuminen

RhGAA:n kapea substraatin sitoutumistasku sijaitsee lähellä katalyyttisen (β/α)8-domeenin β-säikeiden C-terminaalisia päitä ja sitä muotoilevat silmukka N-terminaalisesta β-arkkidomeenista sekä molemmat insertit I ja II (Kuva 2c). GH31-entsyymiperheen entsyymit katalysoivat klassisen Koshlandin kaksoissiirtymäreaktiomekanismin avulla, jolloin anomeerinen hiilikonfiguraatio säilyy tuotteessa. GAA25:n katalyyttisen paikan varhaisen karakterisoinnin ja perheen GH3126,27 mekanistisesti analysoitujen jäsenten homologian perusteella katalyyttinen nukleofiili ja happo/emäs voidaan osoittaa D518:aan ja D616:een. Saadaksemme käsityksen rhGAA:n vuorovaikutuksesta dokumentoidun farmakologisen chaperonin 1-deoksinojirimysiinin16,28 ja sen johdannaisen N-hydroksietyyli-deoksinojirimysiinin29 (DNJ) ja NHE-DNJ:n (NHE-DNJ) kanssa liotimme rhGAA:n kiteitä näillä aktiiviseen paikkaan suuntautuvilla iminosokeri-inhibiittoreilla ja saimme molemmille kompleksien diffraktiotietoja, jotka ulottuivat aina 2,0 Å:n erottelukykyyn asti (taulukko 1). DNJ sitoutuu 4C1-konformaatiossa substraattia sitovaan alapaikkaan -130 ja sitä stabiloivat vetysidokset D404:n, D518:n, R600:n, D616:n ja H674:n sivuketjuihin. Hydrofobiset kontaktit W376:n, I441:n, W516:n, M519:n, W613:n ja F649:n kanssa tarjoavat lisää stabiloivia vuorovaikutuksia (kuva 3a, b). Lukuun ottamatta W376:n sivuketjun 20°:n kallistusta, DNJ:n sitoutuessa rhGAA:n aktiivisessa paikassa ei tapahdu merkittäviä konformaatiomuutoksia. Näin ei ole NHE-DNJ:n sitoutuessa, joka ottaa saman asennon kuin DNJ, mutta jossa hydroksietyylisubstituentti aiheuttaa huomattavia konformaatiomuutoksia M519:n ja W481:n sivuketjuihin (kuvat 3c, d). Tässä ligandin aiheuttamassa konformaatiossa rhGAA:n jäännös W481, joka sijaitsee insertin I kärjessä, muodostaa stabiloivan vuorovaikutuksen NHE-DNJ:n hydroksietyylisubstituentin kanssa. Samanlaisia konformaatiomuutoksia voidaan havaita NHE-DNJ:n sitoutuessa MGAM:n N-terminaaliseen alayksikköön (NtMGAM)31 (Täydentävä kuva 3a).

Substraatin tunnistaminen ja spesifisyys

Kootaksemme käsityksen rhGAA:n substraatin tunnistamisesta hankimme 2,45 Å:n resoluutioon ulottuvat diffraktiodatatan rhGAA-kiteestä, joka oli liotettu akarboosilla, joka on ei-hajautuva α-1,4-tetrasakkaridien substraattianalogi (taulukko 1). Tässä kompleksissa valienamiinirengas, joka on kiinnittynyt alapaikkaan -1, omaksuu 2H3-puolituolikonformaation, mutta huolimatta tästä konformaatioerosta 4C1-puolituolikonformaatioon sitoutuneeseen DNJ:hen nähden, vetysidoskuvio alapaikassa -1 on olennaisesti identtinen näillä kahdella yhdisteellä (kuvat 3e, f ja täydentävä kuva 3b). Ei-vetykytkettävä ”interglykosidinen” typpi sijaitsee katalyyttisessä keskuksessa ja on vetysidoksessa katalyyttisen hapon/emäksen D616 kanssa. Alakohdan + 1 6-deoksiglukosyyliosa muodostaa 2- ja 3-hydroksyyliryhmiensä kautta vetysidoksia konservoituneen R600:n ja D282:n kanssa, joka on peräisin N-terminaalisen β-arkkidomeenin silmukasta. Vaikka tämän silmukan jäännökset eivät ole konservoituneet sekvenssissä, ne ovat poikkeuksetta vuorovaikutuksessa hiilihydraattiligandien kanssa kaikissa käytettävissä olevissa GH31-perheen jäsenten kiderakenteissa. Akarboosin maltoosiyksikkö alapaikoissa + 2 ja + 3 ei ole suorassa vuorovaikutuksessa rhGAA:n kanssa, vaan sitä stabiloivat pikemminkin kideruudun pakkautumisvuorovaikutukset ja veden välityksellä syntyvä kontakti W618:n sivuketjuun, joka sijaitsee substraattia sitovan taskun reunalla. Vuorovaikutusten vähäisyys viittaa siihen, että rhGAA:lla on vain kaksi tuottavaa substraatin sitoutumiskohtaa, alapaikat -1 ja + 1. Mielenkiintoista on kuitenkin se, että rhGAA:han sitoutuneena akarboosimaltoosiosuus on samassa asennossa kuin NtMGAM22:een sitoutuneena, mikä viittaa siihen, että myös alapaikoilla + 2 ja + 3 on toiminnallinen rooli rhGAA:ssa (Täydentävä kuva. 3c).

Glykogeeni on suuri polymeeri, joka rakentuu lineaarisista ketjuista, jotka koostuvat α-1,4-sidoksissa olevista glukoosijäännöksistä ja joissa on α-1,6-sidoksissa olevia haaroja. Sytosolissa energiavarastohiukkanen hajoaa glykogeenifosforylaasin ja erään haarautumisentsyymin samanaikaisen toiminnan ansiosta. Lysosomissa ei ole hajottajaentsyymiä, ja GAA:n on varmistettava sekä α-1,4- että α-1,6-glykosidisidosten hydrolyysi. RhGAA kuitenkin suosii selvästi ensin mainittua sidosta, sillä spesifisyysvakio maltoosille on 32-kertainen verrattuna spesifisyysvakioon isomaltoosille (lisätaulukko 2). Kaksoissubstraattispesifisyyden rakenteellisen perustan selvittämiseksi yritimme liottaa rhGAA-kiteitä ei-hydrolysoituvalla tetrasakkaridilla glukopyranosyyli-α-(1,6)-tio-maltotrioosilla. Tämä ei kuitenkaan onnistunut, mikä johtui todennäköisesti siitä, että kiteiden kontaktit haittasivat tetrasakkaridin, joka α-1,6-sidoksensa vuoksi on hieman pidempi kuin akarboosi, sopeutumista. Jälkimmäisen on havaittu mahtuvan hädin tuskin substraattia sitovaan rakoon ja tukeutuvan tiiviisti symmetriaan liittyvään molekyyliin (kuva 3e). Johdimme rhGAA:n aktiiviseen kohtaan sitoutuneen α-1,6-sidoksisen disakkaridin rhGAA:n ja Blautia obeum GAA:n katalyyttisen (β/α)8-domeenin rakenteellisella päällekkäisyyksellä isomaltoosin32 kanssa kompleksissa (rmsd 1,50 Å 318 kohdistetun Cα-aseman osalta). Malli paljastaa, että alapaikan -1 ja + 1 välisen α-1,6-sidoksen akkommodaatio ei aiheuta steeristä estettä ja että alapaikassa + 1 olevan glykopyranoosiryhmän ja D282:n väliset tuottavat vetysidokset säilyvät (kuva 4a, b). Koska α-1,6-sidoksen pituus on kasvanut α-1,4-sidokseen verrattuna, stabiloiva vetysidos R600:n kanssa on kuitenkin heikentynyt, mikä saattaa selittää entsyymin alhaisemman aktiivisuuden α-1,6-sidoksisilla oksilla.

Sekundaarinen substraattia sitova domeeni

RhGAA-akarboosikompleksissa voitiin havaita, että toisen akarboosimolekyylin akarvosiiniosuus oli jäänyt taskuun N-terminaalisen trefoil-tyypin P-domeenin sisällä, joka sijaitsee samalla puolella rhGAA:ta kuin aktiivinen kohta ja 25 Å:n päässä sinne sitoutuneesta akarboosista (kuva 4c). Valienamiiniryhmä sitoutuu 4- ja 6-hydroksyyliryhmillään vetysidoksisesti C127:n pääketjun typpeen ja happeen, A93:n pääketjun happeen ja D91:n sivuketjuun. Muita stabiloivia vuorovaikutuksia syntyy pinoamisvuorovaikutuksista P125:n ja W126:n kanssa. P125 ja D91 ovat konservoituneet tai ne on korvattu konservatiivisilla substituutioilla perheen GH31 entsyymeissä, jotka sisältävät trefoil-tyypin P-domeenin (täydentävä kuva 4a). Toissijaisen hiilihydraattien sitoutumiskohdan vieressä oleva pintasilmukka G116-M122 oli leikattu proteolyyttisellä käsittelyllä. On mahdollista, että segmentin G116-M122 poistaminen, joka on ainutlaatuinen GH31-perheen lysosomaalisille edustajille (lisäyskuva 4a, b), voi osaltaan vaikuttaa sekundaarisen substraattia sitovan taskun muodostumiseen. Voidaan ajatella, että rhGAA:n toissijainen akarboosia sitova kohta edustaa aitoa substraattia sitovaa kohtaa, joka mahdollisesti parantaa entsyymin prosessointikykyä. Tämä kohta voisi myös toimia farmakofoorina uusien farmakologisten chaperonien in silico -seulonnassa. Erityisesti on huomattava, että akarboosista johdettu trisakkaridi on sitoutunut Gracilariopsis lemaneiformis 33:sta peräisin olevan perheen GH31 α-1,4-glukaanilyaasin N-terminaaliseen domeeniin, joka on lähellä tässä kuvattua sekundaarista substraatin sitoutumiskohtaa (täydentävä kuva 5).

N-asetyylikysteiini on allosteerinen farmakologinen chaperoni

Tunnetun farmaseuttisen lääkeaineen N-asetyylikysteiinin (NAC) on osoitettu toimivan allosteerisena farmakologisena chaperonina, joka parantaa ERT:ssä käytettävän mutoituneen endogeenisen GAA:n ja rhGAA:n stabiilisuutta vaikuttamatta katalyyttiseen aktiivisuuteen18. Hyödyntääksemme NAC:n terapeuttista potentiaalia Pompen taudin hoidossa rakennetutkimusten avulla pyrimme selvittämään rhGAA:n kiderakenteen kompleksissa NAC:n kanssa. Kiteiden liotuskokeilla saadun kompleksin 1,83 Å:n resoluutiorakenne (taulukko 1) paljastaa kaksi NAC:n sitoutumiskohtaa, jotka ovat kaukana aktiivisesta kohdasta (kuva 4d, e), mikä antaa rakenteellista näyttöä siitä, että NAC on todellakin allosteerinen chaperoni, kuten toiminnallisissa tutkimuksissa on odotettu18. Varmistimme aktiivisuusmäärityksillä ja differentiaalipyyhkäisevällä fluorimetrialla, että NAC stabiloi yhtä hyvin rhGAA:ta ja tässä tutkimuksessa tuotettua proteolyyttisesti kypsytettyä entsyymiä ja että chaperoni on spesifinen GAA:ta kohtaan, sillä NAC:lla ei ole stabiloivaa vaikutusta riisin GH31-homologiin (lisäyskuva 6a, b ja lisäystäulukot 3 ja 4). RhGAA-NAC-kompleksin rakenteessa NAC-molekyyli, jota kutsutaan nimellä NAC1, sijaitsee noin 30 Å:n päässä aktiivisesta keskuksesta, (β/α)8-tynnyrin ja distaalisen β-lehtidomeenin rajapinnassa (kuva 4d). NAC1 sitoutuu H432:n pääketjun karboksyyliin sen amiditypen kautta, ja karboksyylifunktio muodostaa veden välityksellä kontaktin D513:n sivuketjuun. Cβ-Sγ- ja asetyyliryhmät muodostavat pinoutuvia vuorovaikutuksia R437:n guanidiiniryhmän ja silmukan G434-G435 kanssa. Toinen, osittain (75 %) miehitetty NAC-molekyyli (NAC2) sijaitsee (β/α)8-tynnyrin ja proksimaalisen β-arkkidomeenin välisellä rajapinnalla 25 Å:n etäisyydellä aktiivisesta kohdasta (kuva 4e). NAC2:n karboksyylifunktio muodostaa vesivälitteisen kontaktin L756:n pääketjun hapen kanssa, tioli pinoutuu Q757:n sivuketjua vasten ja asetyyliryhmä pinoutuu H742:n sivuketjua vasten. Molemmat NAC-molekyylit muodostavat vähemmän ja heikompia vuorovaikutuksia rhGAA:n kanssa kuin chaperonit DNJ ja NHE-DNJ. Tämä heijastaa chaperoniaktiivisuuteen tarvittavia suurempia NAC-pitoisuuksia (mM vs. µM), mistä ovat esimerkkinä differentiaalipyyhkäisevällä fluorimetriamenetelmällä saatu K D -arvo 11,57 ± 0,74 mM ja DNJ:n ja NHE-DNJ:n K i -arvot 3,4 ja 3,0 µM18,29. Kokeellisiin pisteisiin parhaiten sopiva sigmoidinen kyllästymiskäyrä tukee täysin (NAC1) ja osittain (NAC2) miehitettyjä NAC:n allosterisia sitoutumiskohtia (täydentävä kuva 6c). NAC1:n ja NAC2:n asetyyliryhmien ja rhGAA:n välille syntyneiden pinoutumisvuorovaikutusten on vaikutettava merkittävästi sitoutumisenergiaan, koska NAC:hen liittyvillä aminohapoilla, kuten N-asetyyliseriinillä ja N-asetyyliglysiinillä, on yhtä lailla stabiloiva vaikutus rhGAA:han, kun taas asetyloimattomilla vastineilla ei ole vaikutusta18. rhGAA-NAC-kompleksin rakenteessa näkyy, että NAC:n sitoutumiskohtia ympäröivien jäännösten atomiset lämpösiirtymäparametrit ovat pienentyneet sitoutumattomaan rhGAA:han verrattuna, mikä viittaa siihen, että NAC:lla on domeenien välinen stabiloiva funktio (täydentävät kuvat 7a-d). Kiteessä NAC:lla näyttää olevan myös antioksidatiivinen vaikutus, sillä jäännös C938 on hapettunut sulfiinihappomuotoon kaikissa tässä kuvatuissa kiderakenteissa, lukuun ottamatta rhGAA-NAC-kompleksin rakennetta (lisäyskuva 8a, b).

NAC:lla ja iminosugareilla on erilaiset chaperoniprofiilit

Jotkut Pompen tautiin johtavista mutaatioista reagoivat sekä NAC:lle että iminosugareille DNJ ja NB-DNJ, kun taas toisiin mutaatioihin kohdistuu spesifisesti jompikumpi farmakologinen chaperoni16,17,18. Valtaosa GAA-mutaatioista, jotka reagoivat iminosugareiden chaperoniaktiivisuuteen, sijaitsevat joko aktiivisen keskuksen läheisyydessä tai sen kokonaisarkkitehtuuriin vaikuttavissa rakenneosissa. Pompe-potilaiden, fibroblastien ja hiirimallien GAA-mutantit, jotka reagoivat herkimmin NAC:lle (A445P, Y455F ja L552P)18 , sijaitsevat insertioissa I ja II, joissa vastaavat villityyppiset jäännökset vaikuttavat domeenin stabilointiin. A445 yhdessä F487:n kanssa määrittelee insertin I rajat, ja A445P-mutantti todennäköisesti destabiloi koko insertin I telineen (täydentävä kuva 9a). Insertin I sivuketjun Y455 hydroksyyli on vuorovaikutuksessa katalyyttisen domeenin pitkän silmukan kanssa, kun taas insertin II sivuketjun L552 sivuketju on hydrofobisessa vuorovaikutuksessa N-terminaalisen β-lehtidomeenin jäännösten kanssa (täydentävät kuvat 9b, c). Vastaavilla Y455F- ja L552P-mutaatioilla on epäilemättä yleinen epävakauttava vaikutus, jonka NAC selvästi pelastaa. Näin ollen iminosugarien chaperonivaikutusta voidaan pitää rakenteellisesti häiriintyneiden aktiivisten paikkojen konformaatiopelastuksena, kun taas allosteerisen chaperonin NAC:n vaikutus näyttää johtuvan yleisten tai paikallisten konformaatiovaihteluiden vakauttamisesta.