4-1BB/4-1BBL interakció elősegíti az elhízás által kiváltott zsírszöveti gyulladást azáltal, hogy kétirányú gyulladásos jelátvitelt vált ki az adipocitákban/ makrofágokban

Abstract

Az elhízás által kiváltott zsírszöveti gyulladást a makrofágok zsírszövetbe történő toborzása és a gyulladásos citokinek felszabadulása jellemzi. A 4-1BB, egy kosztimuláló receptor, az immunsejtek felszínén lévő ligandumával, a 4-1BBL-lel való kölcsönhatás révén modulálja a gyulladásos folyamatokat. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a zsírsejtek és makrofágok közötti 4-1BB/4-1BBL kölcsönhatás részt vesz-e az elhízás által kiváltott zsírszöveti gyulladásban. Megállapítottuk, hogy a 4-1BB expresszálódott a zsírsejteken, és az elhízással kapcsolatos tényezők felszabályozták, ami a makrofágokon is fokozta a 4-1BBL expresszióját. A 4-1BB és/vagy 4-1BBL agonisták aktiválták a gyulladásos jelátviteli molekulákat (MAPK/IκBα és MAPK/Akt) a zsírsejtekben és a makrofágokban, és fokozták a gyulladásos citokinek (MCP-1, TNF-α és IL-6) felszabadulását. Ezenkívül a 4-1BB/4-1BBL kölcsönhatás megszakítása csökkentette a gyulladásos citokinek felszabadulását a kontakt kokultúrás zsírsejtekből/makrofágokból. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a 4-1BB/4-1BBL által közvetített kétirányú jelátvitel a zsírsejtekben/makrofágokban elősegíti a zsírszöveti gyulladást. A 4-1BB és a 4-1BBL hasznos célpontok lehetnek az elhízás okozta zsírszöveti gyulladás elleni védelemben.

1. Bevezetés

Az elhízás által kiváltott gyulladást az olyan anyagcserezavarok lehetséges okának tekintik, mint az inzulinrezisztencia, a 2-es típusú cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek . A zsírszövet aktívan részt vesz az elhízás által kiváltott gyulladásban a makrofágok és T-sejtek toborzásán és a gyulladásos citokinek (monocita kemotaktikus protein-1, MCP-1; tumor nekrózis faktor alfa, TNF-α; interleukin-6, IL-6) felszabadításán keresztül, amelyek modulálják a zsírsejtek differenciálódását, anyagcseréjét és a helyi/rendszeri gyulladásos válaszokat, nemkívánatos metabolikus egyensúlytalanságokat okozva . Érdekes módon a közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy az adipociták és a makrofágok közvetlen kontaktusos kokultúrája a gyulladásos citokinek jelentősen megnövekedett felszabadulását eredményezi, ami azt jelzi, hogy az e sejtek sejtfelszíni molekulái közötti kölcsönhatás fontos a gyulladásos válaszok elősegítésében.

4-1BB (más néven CD137 és TNFRSF9) egy klasszikus példája a kosztimuláló molekulának, és egy jól ismert gyulladásos receptor, amelyet az aktivált T-sejtek a gyulladásos helyeken expresszálnak . A 4-1BB stimulálása a T-sejteken a sejtek terjeszkedéséhez, citokintermeléshez és citolitikus effektor funkciók kialakulásához vezet . A 4-1BB ligandum (4-1BBL, más néven CD137L és TNFSF9) a legtöbb immun- és számos nem immunsejt által nagymértékben kifejezett, és képes fordított jeleket fogadni és továbbítani olyan sejtekbe, mint a makrofágok . A felhalmozódó bizonyítékok azt mutatják, hogy a kétirányú sejtfelszíni 4-1BB/4-1BBL kölcsönhatások az immunsejtekben kritikus szerepet játszanak a különböző gyulladásos válaszok (pl. reumatoid artritisz, autoimmun myocarditis és hematológiai malignitások) elindításában és modulálásában . Ezenkívül a 4-1BB/4-1BBL által közvetített kölcsönhatások az immunsejtek és a nem immunsejtek között is előfordulnak, ami szintén befolyásolja a gyulladásos válaszokat. Például a 4-1BB és 4-1BBL közötti kölcsönhatás az endotélsejteken és a makrofágokon részt vesz az érrendszeri gyulladásban , és a két molekula közötti kölcsönhatás a hámsejteken és a természetes ölősejteken részt vesz a vese iszkémiás-reperfúziós károsodásában . Korábban kimutattuk, hogy a 4-1BB és a 4-1BBL expressziója felszabályozott az elhízás miatt gyulladt zsírszövetben, és hogy a 4-1BB ablációja csökkentette a zsírszöveti gyulladást. Ezért feltételeztük, hogy a zsírsejteken és az immunsejteken, például a makrofágokon lévő 4-1BB és 4-1BBL közötti kölcsönhatás szerepet játszik a zsírszöveti gyulladásban az elhízásban.

Ebben a tanulmányban mutatjuk be először, hogy a 4-1BB expresszálódik a zsírsejteken, és az elhízással kapcsolatos tényezők felszabályozzák, és bizonyítjuk, hogy a 4-1BB/4-1BBL által közvetített kétirányú jelátvitel a zsírsejtekben/makrofágokban döntő szerepet játszik az elhízás által kiváltott zsírszöveti gyulladásos kaszkád elindításában és elősegítésében.

2. Anyagok és módszerek

2.1. A 4-1BB/4-1BBL által közvetített kétirányú jelátvitel a zsírsejtekben/makrofágokban. Állatok

C57BL/6 egereket (hímek, 8 hetesek) (Orient Ltd., Busan, Korea) magas zsírtartalmú étrenddel (HFD, a kalória 60%-a zsírból származik (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); elhízott egerek) vagy alacsony zsírtartalmú étrenddel (LFD; a kalória 10%-a zsírból származik (Research Diets); nem elhízott egerek) etettek 9 hétig. Minden állatkísérletet az Ulsani Egyetem állatetikai bizottsága hagyott jóvá, és megfelelt a National Institutes of Health irányelveinek.

2.2. Antitestek

Az aszcitaképződés kiváltása érdekében az egereket pristánnal alapoztuk és intraperitoneálisan befecskendeztünk egy 4-1BB (3E1) elleni agonista monoklonális antitestet (Ab) előállító szubklónozott hibridomát. A monoklonális Ab-t az ascites folyadékból protein G-Sepharózzal (Sigma-Aldrich) végzett affinitás oszlopkromatográfiával tisztítottuk. A rekombináns 4-1BB Fc-t (r4-1BB Fc) az Adipogen-től (Szöul, Korea) vásároltuk. A 4-1BBL elleni antagonista monoklonális Ab-t (TKS-1) az e-Bioscience-től (San Diego, CA, USA) vásároltuk. A patkány immunglobulin G-t (Rat IgG) és a humán IgG1-et a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk, és kontrollként használtuk.

2.3. Sejtkultúrák és kezelések

A Raw264.7 egér makrofág sejtvonalat a Korean Cell Line Bankból (KCLB40071, Szöul, Korea) nyertük. Ezt a sejtvonalat RPMI1640-ben (Gibco BRL, NY, USA) tartottuk fenn, amely 10% (vol/vol) FBS-t (magzati szarvasmarha szérum) (Gibco BRL, NY, USA) tartalmazott, és 37°C-on, párásított 5% CO2-ben inkubáltuk. A 3T3-L1 preadipocitákat 10% FBS-t tartalmazó DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) magas glükóz tartalmú (Gibco BRL, NY, USA) közegben tartottuk. A konfluens 3T3-L1 preadipocitákat (0. nap) 10 μg/mL inzulint (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX-et (dexametazon, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX-et (3-izobutil-1-metil-xantin, Sigma-Aldrich) és 10% FBS-t tartalmazó DMEM-ben inkubáltuk 2 napig. Röviden, a 3T3-L1 sejteket érett adipocitákká differenciálták DMEM-ben 10% FBS-t és 5 μg/ml inzulint tartalmazó DMEM-ben történő inkubálással 2 napig. Az érett adipocitákat ebben a tápfolyadékban tartottuk fenn, és a tápfolyadékot 2 naponta friss tápfolyadékra cseréltük. A szabad zsírsavat (FFA, palmitinsav-keverék, Sigma-Aldrich) szarvasmarha-szérumalbumin (BSA, 25 μM) etanolban oldottuk, és felhasználás előtt 10 : 1 mólarányban BSA-val konjugáltuk. A 3T3-L1 adipocitákat (3 × 105 sejt/lyuk) vagy a Raw264.7 makrofágokat (3 × 105 sejt/lyuk) 24 lyukú lemezekben 24, illetve 4 órán keresztül kezeltük elhízással kapcsolatos faktorokkal (palmitinsav : pal, lipopoliszacharid : LPS). A 4-1BB stimulálása érdekében az adipocitákon a 24 lyukú lemezeken lévő 3T3-L1 adipocitákat agonista 4-1BB Ab-val (3E1, 1 μg/ml) vagy patkány IgG-vel inkubáltuk 48 órán keresztül szérummentes közegben. Az r4-1BB Fc vagy humán IgG1 immobilizálásához a tenyésztőlemezeken 24 lyukú lemezeken r4-1BB Fc-t vagy humán IgG1-et inkubáltunk 37°C-on 1 órán át CO2 inkubátorban, majd a lyukakat foszfát pufferelt sóoldattal (PBS) öblítettük. Ezután a lemezeket RPMI-vel (10% FBS) inkubáltuk 37°C-on 1 órán át CO2 inkubátorban, majd a mélyedéseket PBS-szel öblítettük. A nyers264.7 makrofágokat 5 × 105 sejt/lyuk mennyiségben inkubáltuk 24 lyukú lapos aljú lemezekben, amelyeket 100 ng/ml r4-1BB Fc-vel vagy humán IgG1-gyel előkezeltünk 24 órán keresztül.

2.4. Sztromális érsejtek izolálása zsírszövetből

A zsírszövet sztromális érfrakciójának (SVF) izolálásához C57BL/6 egerek (hím, 8 hetes) epididymialis zsírpárnáit daráltuk és 30 percig 37°C-on emésztettük 2-es típusú kollagenázzal (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) DMEM-ben (pH 7,4). Az így kapott szuszpenziókat 5 percig 500 g-nél centrifugáltuk. A pelleteket erythrocyte lysis pufferben reszuszpendáltuk, és a szuszpenziókat 3 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 5 percig 500 g-nél centrifugáltuk. DMEM-ben történő mosás után a szuszpenziókat steril 100 μm-es nejlonhálón (SPL Lifescience, Pocheon, Korea) vezettük át. A leszűrt sejteket 100 mm2 -es, 10% FBS-szel és 0,4% Fungizone-nal kiegészített DMEM-et tartalmazó edényekbe helyeztük át, és 37°C-on, 5% CO2 mellett inkubátorban tartottuk. A sejteket hagytuk megtapadni, és a lebegő sejteket aspirációval eltávolítottuk, majd a táptalajt minden nap újratöltöttük. Az SVF sejteket 2 nap múlva gyűjtöttük össze. Az SVF sejteket 5 × 105 sejt/lyuk mennyiségben 24 lyukú lemezekbe ültettük. A konfluens SVF-ből származó preadipocitákat adipocitákká differenciáltuk 10 μg/mL inzulint (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX-et (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX-et (Sigma-Aldrich) és 10% FBS-t tartalmazó DMEM-mel történő kezeléssel 2 napig. Az érett adipocitákat a táptalajban tartottuk, amelyet 2 naponta friss táptalajra cseréltünk. A 4-1BB és 4-1BBL expresszió kimutatására az elhízási faktoroknak kitett SVF-eredetű adipocitákon, ezeket a sejteket palmitinsavval 250 μM, LPS 100 ng/ml 24 órán keresztül inkubáltuk.

2.5. Peritoneális makrofágok izolálása

C57BL/6 egereket (hímek, 8 hetesek) 4 nappal az elpusztítás előtt intraperitoneálisan 3 ml 3%-os tioglikollát levest (Difco, Detroit, MI, USA) injektáltunk. A peritoneális makrofágokat MEM médiumban (Minimum Essential Medium, Gibco) centrifugálással gyűjtöttük össze, majd a kapott pelletet mostuk és 10% FBS-t tartalmazó MEM táptalajban reszuszpendáltuk. A peritoneális makrofágokat 2 órán keresztül szövettenyésztő lemezekhez való tapadással tisztítottuk. A 4-1BB és 4-1BBL expresszió kimutatására az elhízási tényezőknek kitett peritoneális makrofágokon, ezeket a sejteket 250 μM palmitinsavval, LPS 100 ng/ml-rel inkubáltuk 4 órán keresztül.

2.6. Adipociták és makrofágok kokultúrája

3T3-L1 adipocitákat tenyésztettünk és differenciáltunk 6 napig. Az adipociták és makrofágok kokultúráját két módszerrel végeztük: közvetlen kontakt kokultúra és transzwell kokultúra. A közvetlen kontakt rendszerben Raw264.7 makrofágokat (3 × 105 sejt: 50% makrofág, 3 × 104 sejt: 10% makrofág) vagy peritoneális makrofágokat (3 × 105 sejt) helyeztünk 3T3-L1 adipocitákat (3 × 105 sejt) tartalmazó 24 lyukú lemezekbe. A sejteket 24 órán keresztül egymással érintkezve tenyésztettük, majd betakarítottuk őket. Kontrollként az adipocitákat és a makrofágokat külön-külön is tenyésztettük, a lyukankénti sejtszám megegyezett a kontakt rendszerben lévővel, és a betakarítás után összekevertük őket. A trans-well rendszerben a sejteket 0,4 μm-es porózus membránnal (Corning, NY, USA) ellátott trans-well betétek segítségével kokultiváltuk, hogy az adipocitákat (3 × 105 sejt, alsó lyuk) és a makrofágokat (3 × 105 sejt, felső lyuk) elkülönítsük. A 4 órás, 8 órás és 12 órás inkubációt követően a felülúszókat összegyűjtöttük.

2.7. A citokinszintek mérése

A citokinszinteket a tenyésztési felülúszókban enzimhez kötött immunoszorbens tesztekkel (ELISA) mértük. A vizsgálatokat OptEIA egér TNFα, egér MCP-1 készlet (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) és egér IL-6 és adiponektin készlet (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), valamint IL-10 készlet (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) használatával végeztük. A citokinszintek értékeit a SOFTmax görbeillesztő program (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) segítségével standard görbékből származtattuk.

2.8. Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)

A tenyésztett sejtekből kivont teljes RNS-t reverz transzkripcióval, M-MLV reverz transzkriptáz (Promega, Madison, WI, USA) segítségével cDNS előállítására írtuk át. A cDNS valós idejű PCR-amplifikációját két példányban végeztük SYBR premix Ex Taq kit (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) segítségével Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Japán) segítségével. Minden reakciót ugyanazzal az eljárással végeztünk: kezdeti denaturálás 95°C-on 10 másodpercig, majd 45 ciklus 95°C-on 5 másodpercig és 60°C-on 30 másodpercig. Az érdeklődésre számot tartó gének minden értékét a házőrző gének értékeire normalizáltuk (36B4 az adipociták esetében; β-aktin a makrofágok és a kokultúrák esetében). A felhasznált egérprimer szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza.

Az adatokat a Thermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.) segítségével elemeztük. A relatív standard görbéket a ciklusküszöb (Ct) értékek ábrázolásával hoztuk létre. Az egyes mintákból kapott Ct-értékek alapján a célgének relatív mennyiségét a Takara Thermal Cycler Dice Real Time System által biztosított szoftverrel számoltuk ki a standardgörbék segítségével.

2.9. Adipociták és makrofágok szétválasztása

Kokultúrázott 3T3-L1 adipocitákat és Raw264.7 makrofágokat azonos számban (a korábban leírtak szerint) a gyártó protokollját követve, CD11b MicroBeads rendszer (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA) segítségével választottuk szét. Röviden, a kokultúrás sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk pufferrel (2 mM EDTA-val és 0,5% szarvasmarha szérumalbumin-BSA-val kiegészített PBS), majd CD11b mikrogyöngyökkel inkubáltuk 15 percig 4°C-on. A mosott és reszuszpendált sejteket MACS oszlopra vittük, amely visszatartotta a CD11b+ sejteket és átengedte a negatív sejteket (adipocitákat). Az oszlopot ezután eltávolítottuk a szeparátorból, és egy megfelelő gyűjtőcsőre helyeztük. Megfelelő mennyiségű oszloppuffert pipettáztunk az oszlopra a pozitív sejtek (makrofágok) kiöblítéséhez az oszlophoz mellékelt dugattyú segítségével. Ez a módszer 90-95%-ban tiszta CD11b+ sejteket eredményezett, áramlási citometriával értékelve.

2.10. Áramlási citometriás (FACS) elemzés

3T3-L1 adipociták és Raw264.7 elhízással kapcsolatos faktorokkal kezelt makrofágokat (a korábban leírtak szerint) óvatosan tripszináltuk, kétszer mostuk PBS-ben, és 10 percig jégen inkubáltuk Fcγ receptor-blokkoló antitestekkel (24G2), majd fikoeritrin (PE) konjugált anti-4-1BB-vel (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-4-1BBL (eBioscience), vagy anti-Rat (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) és anti-CD11b (eBioscience) mint kontroll az adipociták/makrofágok kapujának meghatározásához. A sejteket ezután FACS-pufferrel mostuk, majd FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) FACS-berendezésen elemeztük CellQuest szoftverrel (BD Biosciences). A grafikonokon szereplő számok a pozitív sejtek százalékos arányát jelzik.

2.11. Western Blot analízis

3T3-L1 adipocitákat 1 × 106 sejt/hellyel 6 lyukú lemezekbe ültettünk, és 3E1 (1 μg/mL) vagy patkány IgG-vel inkubáltuk 3 órán keresztül. Raw264.7 makrofágokat 1 × 106 sejt/hellyel ültettünk 6 lyukú lemezekbe r4-1BB Fc-vel vagy humán IgG-vel bevonva 1 órán keresztül. A 3E1-kezelt adipocitákat és az r4-1BB Fc-vel kezelt makrofágokat PBS-szel öblítettük, lízispufferben (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5% dezoxikolát, 1% IGEPAL és proteáz inhibitor koktél) kaparással reszuszpendáltuk, és 5 percig 3000 rpm-en centrifugáltuk. A 10-30 μg összfehérjét tartalmazó mintákat western blot analízisnek vetettük alá a foszforilált IKK (I kappa B kináz alfa/béta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), teljes IKKβ, p-p38 MAPK (mitogén-aktivált-protein kináz), p-JNK (c-Jun amino-terminális kináz), teljes JNK, p-Akt (protein kináz B; Ser473), teljes Akt (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) és IκBα (a nukleáris faktor-κB alfa inhibitora; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), valamint β-aktin (Sigma).

2.12. Statisztikai elemzés

Az eredményeket három független, két példányban elvégzett vizsgálat átlaga ± SEM értékeként adjuk meg. A statisztikai összehasonlításokat Student-teszt vagy ANOVA segítségével végeztük Duncan többszörös tartománytesztjével. A különbségeket .

3. eredmények

3.1. szignifikánsnak tekintettük. A 4-1BB és a 4-1BBL expressziója az adipocitákban/ makrofágokban és a zsírszövetben

Először qRT-PCR segítségével mértük a 4-1BB expresszióját az adipogenezis során mRNS-szinten. Azt találtuk, hogy a 4-1BB transzkriptumok szintje nagyobb volt az SVF-ből származó adipocitákban a differenciálódás után (1. ábra (a)). Fontos, hogy az elhízással kapcsolatos anyagok, mint a palmitinsav és az LPS jelentősen felszabályozták a 4-1BB transzkriptek szintjét az SVF-ből származó adipocitákban és a 4-1BBL transzkriptek szintjét a peritoneális makrofágokban (1(b) ábra). A transzkriptek upregulációja megerősítést nyert 3T3-L1 adipocitákban és/vagy Raw264.7 makrofágokban (1. ábra (c)). A FACS-elemzés azt is kimutatta, hogy a 3T3-L1 adipocitákon a 4-1BB fehérjét és a Raw264.7 makrofágokon a 4-1BBL fehérjét (1. ábra (d)) megnövelték ezek az elhízással kapcsolatos tényezők. Ezenkívül a 4-1BB és 4-1BBL transzkriptek megnövekedtek a kokultúrázott adipocitákban/makrofágokban (1. ábra (e)), valamint a HFD-vel táplált elhízott egerek epididymális zsírszövetében (1. ábra (f)).

3.2. Gyulladásos citokinek felszabadulása és a gyulladásos jelzőmolekulák aktiválása 4-1BB és 4-1BBL stimuláció hatására az adipocitákban és makrofágokban, illetve

Hogy megvizsgáljuk, hogy a 4-1BB az adipocitákon vagy a 4-1BBL a makrofágokon gyulladásos jelzést ad-e, mindkét sejttípust olyan agonistákkal kezeltük, amelyek specifikusan stimulálják ezeket a molekulákat; A 3T3-L1 adipocitákat agonista 4-1BB antitesttel (3E1) kezeltük 48 órán keresztül, és a Raw264.7 makrofágokat r4-1BB-Fc-vel 24 órán keresztül, majd megmértük a gyulladásos citokinek szintjét az adott sejtekben. Mind a zsírsejtek 4-1BB-stimulációja, mind a makrofágok 4-1BBBL-stimulációja jelentősen megnövelte a proinflammatorikus citokinek, például az MCP-1, TNF-α és IL-6 termelését mRNS (2. ábra (a) és 2. ábra (c)) és fehérjeszinten (2. ábra (b) és 2. ábra (d)). Az adiponektin szekrécióját az adipocitákból a 4-1BB stimuláció nem változtatta meg (az adatok nem láthatóak). A makrofágok 4-1BBBL-stimulációja csökkentette az IL-10 transzkriptumát (2(c) ábra), de az IL-10 fehérje felszabadulásában nem volt változás (2(d) ábra).

Ábra 2

4-Az 1BB vagy 4-1BBL stimuláció fokozza a különböző gyulladásos citokinek felszabadulását az adipocitákból vagy makrofágokból. A 3T3-L1 adipocitákat és a Raw264.7 makrofágokat 1 μg/ml 3E1 és 100 ng/ml r4-1BB Fc-vel kezeltük 48-24 órán keresztül. Ezt követően MCP-1, TNF-α, IL-6 és IL-10 transzkripteket és fehérjéket mértünk a 3T3-L1 adipocitákban (a-b) és a Raw264.7 makrofágokban (c-d). Az IKKα/β (p-IKKα/β)/IKKβ, IκBα, p-p38, p-JNK/JNK, pAkt/Akt és β-aktin foszforilációját western blottinggal mértük. A 3T3-L1 adipocitákat 1μg/mL 3E1-gyel inkubáltuk 3 órán keresztül (e), a Raw264.7 makrofágokat pedig 100 ng/mL r4-1BB Fc-vel 1 órán keresztül (f). A denzitometria eredményeit a kontroll százalékában mutattuk ki. Az adatok három független, két példányban végzett kísérlet átlaga ± SEM. ; ; ; ; (kontrollhoz képest).

Annak érdekében, hogy megértsük azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek révén a 4-1BB és/vagy 4-1BBL aktiválja a gyulladásos jelátvitelt a zsírsejtekben és/vagy makrofágokban, megvizsgáltuk a 4-1BB/4-1BBL stimuláció hatását az intracelluláris jelátviteli molekulákra. A 4-1BB stimulálása az adipocitákon növelte a p38 MAPK és a JNK foszforilációját, valamint az NF-κB upstream molekulájának, az IKK-nak a foszforilációját, és indukálta az IκBα degradációját (2. ábra (e)), míg a 4-1BBL stimulálása növelte az Akt és a p38 MAPK, valamint a JNK foszforilációját (2. ábra (f)), de nem volt hatással az IκBα fehérje degradációjára (2. ábra (f)) és az IKK foszforilációjára (adat nem látható). Összhangban a korábbi jelentésekkel , a 4-1BBL jelátvitel nem csak a p38 MAPK-t aktiválta, hanem Akt aktivációt is indukált a makrofágokban, ami a gyulladásos citokinek fokozott expressziójához vezetett.

3.3 . Gyulladásos citokinek felszabadulása kontakt kokultúrás rendszerben

Mivel a 4-1BB/4-1BBL stimuláció fokozta a gyulladásos citokinek felszabadulását az adipocitákból és/vagy makrofágokból, megvizsgáltuk, hogy a sejt-sejt interakció a felszíni molekulákon, feltehetően a 4-1BB/4-1BBL-en keresztül szerepet játszik-e a gyulladásos válaszok elindításában és kiváltásában. Először 3T3-L1 adipocitákat és Raw264.7 makrofágokat kokultúráztattunk közvetlen kontaktusos rendszerben, és azt találtuk, hogy az IL-6, MCP-1 és TNF-α gyulladásos citokinek termelése korrelált a makrofágok számával a kultúrában (3(a)-3(c) ábrák), és idővel növekedett (3(d)-3(f) ábrák).

3.4. A 4-1BB és 4-1BBL közötti kölcsönhatás megszakításának hatása a gyulladásos citokinek felszabadulására kontakt kokultúrás rendszerben

Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a 4-1BB/4-1BBL által közvetített kölcsönhatás a zsírsejtek és makrofágok között részt vesz-e a gyulladásos válaszban a kontakt kokultúrás 3T3-L1 zsírsejtek/Raw264.7 makrofágok esetében, semlegesítő ellenanyaggal (TKS-1) blokkoltuk a kölcsönhatást. A semlegesítő monoklonális antitest specifikusan reagál az egér 4-1BBL-lel, amely által a 4-1BBL nem tud kötődni a 4-1BB receptorhoz, és képes megszakítani a 4-1BBL és a 4-1BB közötti kölcsönhatást. Ezért mind a 4-1BB által közvetített jel a zsírsejtekben, mind a 4-1BBL által közvetített jel a makrofágokban TKS-1 kezeléssel tompítható. Azt találtuk, hogy a TKS-1 kezelés jelentősen csökkentette az IL-6, MCP-1 és TNF-α mRNS szintjét a kontaktusban kokultúrázott adipocitákban/makrofágokban (4. ábra (a)). E gyulladásos citokinek expressziójának csökkenését fehérjeszinten is megerősítettük (4. ábra (b)). Továbbá azt is megállapítottuk, hogy a 4-1BB és a 4-1BBL közötti kölcsönhatás megszakítása csökkentette a gyulladásos citokinek felszabadulását az adipocitákkal kokultúrázott peritoneális makrofágokból (4(c) ábra). A 4-1BB és a 4-1BB jelátvitel gyulladásos génexpresszióhoz való relatív hozzájárulásának vizsgálatához a kokultúrázott adipocitákban/macrofágokban a makrofágokat elválasztottuk az adipocitáktól, és megmértük a gyulladásos citokin transzkriptek szintjét a két sejttípusban (4. ábra (d)). A semlegesítő antitest jelentősen csökkentette az IL-6, MCP-1 és TNF-α mRNS szintjének növekedését mind az adipocitákban, mind a makrofágokban (4(e) és 4(f) ábra).

4. Megbeszélés

Az elhízás okozta zsírszöveti gyulladásra jellemző a makrofágok toborzása a zsírszövetbe, és a makrofágok a gyulladásos válaszok fontos forrásai. A zsírsejtek és a makrofágok közötti sejt-sejt kapcsolatot fontosnak tartják a gyulladásos útvonalak kiváltásában a zsírszövetben , bár nem világos, hogy mely molekulák játszanak szerepet. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a 4-1BB ko-stimuláló receptor és ligandja, a 4-1BBL sejt-sejt kontaktuson keresztül történő érintkezése modulálja a különböző gyulladásos válaszokat . Korábbi munkáinkban azt találtuk, hogy a 4-1BB hiánya a makrofágok toborzásának és a gyulladásos citokinek felszabadulásának csökkentése révén csökkentette a zsírszövet gyulladását . Ezen eredmények alapján feltételeztük, hogy a 4-1BB/4-1BBL által közvetített sejt-sejt interakció a zsírsejtek és a makrofágok között fontos szerepet játszhat az elhízás okozta zsírszöveti gyulladás kialakulásában és/vagy fenntartásában. Érdekes módon a 4-1BB transzkriptumokat az adipocitákban és a 4-1BBL transzkriptumokat a makrofágokban az elhízással kapcsolatos tényezők (pl. FFA és LPS) jelentősen felszabályozták, és expressziójuk a kokultúrázott adipociták/makrofágok kontaktusában is erősen megnövekedett. Ráadásul e molekulák upregulációját gyulladásos citokinek fokozott felszabadulása kísérte a sejtekből. Ezek az eredmények az elhízott zsírszövetben észlelt upregulációval és a 4-1BB-hiányos elhízott egerekben a zsírszöveti gyulladás csökkenésével együtt arra utalnak, hogy a 4-1BB és a 4-1BBL részt vesz az adipociták/macrofágok által kiváltott gyulladásos válaszok kialakulásában és/vagy elősegítésében.

Azért, hogy kiderítsük, hogy a 4-1BB az adipocitákon vagy a 4-1BBL a makrofágokon felelős-e a gyulladásos válaszokat kiváltó gyulladásos jelekért, olyan agonistákkal stimuláltuk a sejteket, amelyek specifikusan kötődnek a 4-1BB-hez vagy a 4-1BBL-hez. Először találtuk, hogy a 4-1BB stimulálása a zsírsejteken jelentősen megnövelte a gyulladásos citokinek, az MCP-1, a TNF-α és az IL-6 felszabadulását. A 4-1BBL által közvetített fordított jelátvitel stimulálása, amelyről ismert, hogy aktiválja a makrofágokat , szintén növelte a gyulladásos citokinek szintjét. A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy a 4-1BB jelátvitel a MAPK/NF-κB útvonal aktiválódását eredményezi, amely a TNF receptor-asszociált faktor (TRAF)-2 függő a limfocitákban . A zsírsejtekben azt találtuk, hogy a 4-1BB stimulálása aktiválta a p38 MAPK-t, a JNK-t, az IKK-t és indukálta az IκBα fehérje degradációját. Másrészt a 4-1BBL stimulálása a makrofágokban a gyulladásos jelátviteli molekulák, például az Akt és a p38 MAPK aktiválódásához vezetett, ami összhangban van a korábbi vizsgálatokkal . Ami még fontosabb, azt találtuk, hogy a 4-1BBL semlegesítő antitesttel történő kezelés csökkentette a gyulladásos citokinek felszabadulását a kokultúrákban mind mRNS-, mind fehérjeszinten. Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a 4-1BB/4-1BBL által közvetített interakció a zsírsejtek és a makrofágok között kétirányú gyulladásos jelátvitelt vált ki, és erőteljes gyulladásos válaszokat indukál az elhízott zsírszövetben (5. ábra).

5. ábra

Az adipociták és makrofágok közötti 4-1BB/4-1BBL-mediált interakció által kiváltott kétirányú jelátvitel sematikus ábrázolása. Úgy tűnik, hogy a gyulladásos citokinek (MCP-1, TNF-α és IL-6) felszabadulása a kétirányú jelátvitel hatására részt vesz a zsírszövet gyulladásában.

Érdekes, hogy a 4-1BB/4-1BBL kölcsönhatás megszakítása nem nyomta el teljesen a gyulladásos citokinek felszabadulását a kokultúrázott zsírsejtekből és makrofágokból. Ennek oka lehet más sejtfelszíni molekulák jelenléte, amelyek részt vesznek a sejt-sejt kölcsönhatásokban és közvetítik a gyulladásos válaszokat. Az adipociták és a makrofágok ugyanis számos gyulladásos receptort és ligandumot fejeznek ki a felszínükön . Például a CD40 és a herpeszvírus belépési mediátor (HVEM), amelyek a zsírsejteken expresszálódnak, a makrofágok kapcsolatfüggő jelátvitelének közvetítőinek tekinthetők, és e receptorok ablációja csökkenti az elhízás által kiváltott gyulladásos válaszokat . Így elképzelhető, hogy a 4-1BB és 4-1BBL mellett más receptorok és ligandumok is részt vesznek a zsírsejtek és makrofágok közötti kölcsönhatásban, amely a gyulladásos válaszok megindulásához és fenntartásához vezet.

Végeredményben először bizonyítottuk, hogy a 4-1BB és 4-1BBL által közvetített, kétirányú jeleket generáló, kontaktusfüggő kölcsönhatás az adipociták és a makrofágok között döntő szerepet játszik a zsírgyulladásos citokinek e sejtekből történő felszabadulásában. A 4-1BB és a 4-1BBL, valamint más, az adipociták és makrofágok közötti sejt-sejt kölcsönhatásban részt vevő molekulák értékes célpontok lehetnek az elhízás okozta zsírszöveti gyulladás megelőzésében.

Érdekütközés

A szerzők kijelentik, hogy nincs érdekellentét.

Köszönet

Ezt a munkát az Oktatási, Tudományos és Technológiai Minisztérium (MEST) által finanszírozott Midcareer kutatási program támogatta a Nemzeti Kutatási Alap (NRF) KOSEF (2009-0079485) támogatásával, valamint a koreai NRF Tudományos Kutatóközpont programja (Center for Food & Nutritional Genomics) Grant (2012-000000643) támogatásával, amelyet a MEST finanszírozott.