- Abstract
- 1. Bevezetés
- 2. Anyagok és módszerek
- 2.1. Anyagok és módszerek 2.1. Az ABCA1 és ABCG1 gének expressziójának értékelése. Alanyok
- 2.2. A vizsgálatból való kizárás. Vérvétel
- 2.3. Perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC-k)
- 2.4. RNS extrakció és cDNS szintézis
- 2.5. Primertervezés
- 2.6. A szérum biokémiai tényezőinek értékelése
- 2.7. Elemzés és az eredmények értelmezése
- 3. Eredmény
- 3.1. táblázat. A qRT-PCR eredményei
- 3.2. A génexpresszió értékelése a PBMC-ben
- 4. Megbeszélés
- Érdekütközés
- A köszönetnyilvánítás
Abstract
Az ABCA1 és ABCG1 gének koleszterin transzporter fehérjéket kódolnak, amelyek kulcsszerepet játszanak a koleszterin- és foszfolipid homeosztázisban. A vizsgálat célja az ABCA1 és ABCG1 gének expressziójának értékelése és összehasonlítása volt metabolikus szindrómás betegekben és egészséges egyénekben. Ezt az eset-kontroll vizsgálatot 36 metabolikus szindrómás betegen és ugyanennyi egészséges egyénen végezték Hamadanban (Irán nyugati része) 2013-2014-ben. A teljes RNS-t mononukleáris sejtekből vonták ki és RNeasy Mini Kit oszlop segítségével tisztították. Az ABCA1 és ABCG1 gének expresszióját qRT-PCR segítségével végeztük. A lipidprofilt és az éhgyomri vércukorszintet kolorimetriás eljárással mértük. Az ABCG1 expressziója a metabolikus szindrómás betegeknél szignifikánsan alacsonyabb volt (kb. 75%) a kontrollcsoportéhoz képest, míg az ABCA1 expressziója esetében nem volt szignifikáns különbség a két vizsgált csoport között. Más paraméterek, mint a HDL-C, az FBS, a BMI, a derékkörfogat, valamint a szisztolés és diasztolés vérnyomás összehasonlítása a metabolikus szindrómás betegek és az egészséges egyének között jelentős különbségeket mutatott (). Az ABCG1 expressziójának csökkenése a metabolikus szindrómás betegeknél az egészséges egyénekhez képest arra utal, hogy a transzporterkapacitást meghaladó hiperglikémia, a kapcsolódó metabolitok és a hiperlipidémia az ABCG1 csökkent expresszióját eredményezte. Az ABCA1 génexpresszió szignifikáns változásának hiánya a két csoport között az ABCA1 expresszió eltérő szabályozási mechanizmusára utalhat.
1. Bevezetés
A metabolikus szindrómát (MetS) a cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek (CVD) egymással összefüggő kockázati tényezőinek együtteseként határozzák meg . A metabolikus szindróma klinikai diagnózisának van néhány kritériuma, amelyek közé tartozik az emelkedett derékkörfogat (≥102 cm férfiaknál és ≥88 cm nőknél), az emelkedett trigliceridszint (≥150 mg/dl vagy 1.7 mmol/l), csökkent nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin (HDL-C <40 mg/dl vagy 1,03 mmol/l férfiaknál és <50 mg/dl vagy 1,3 mmol/l nőknél) és emelkedett vérnyomás (≥130 mm Hg szisztolés vérnyomás vagy ≥85 mm Hg diasztolés vérnyomás) . A MetS e kritériumok közül három megfigyelésével diagnosztizálható. Az elmúlt években világszerte nőtt a MetS prevalenciája ; az Amerikai Egyesült Államokban azonban az 1999/2000-es 25,5%-ról 2009/2010-re 22,9%-ra csökkent . Weiss és munkatársai arról számoltak be, hogy az elhízás közvetlenül összefügg a MetS fokozott prevalenciájával . Fordított összefüggés van a CVD és a plazma HDL-C szintje, a metabolikus szindróma egyik kritériuma között . A nagy sűrűségű lipoprotein, a keringési lipoproteinek egyik alfrakciója, fontos szerepet játszik a koleszterin szállításában a perifériás szövetekből a májsejtekbe . A HDL gazdag Apo A-I és Apo A-II fehérjékben, és tartalmának több mint kétharmada Apo A-I .
Az ABC transzmembrán transzporterek fontos szerepet játszanak a koleszterin felvételében a makrofágokból a HDL-be és csökkentik a habsejtek képződését . A 2261 aminosavból álló ABCA1 a legtöbb szövetben jelen van. Az utóbbi években kimutatták, hogy az ABCA1 alapvető szerepet játszik a szív- és érrendszeri betegségek elleni védelemben . A HDL-szintézis közvetlenül függ az ABCA1 aktivitásától a májsejtekben; más szóval, kulcsszerepe van az artériás sejtek habsejtek elleni védelmében a plazma HDL-jének növelésén keresztül. Az artériás makrofágok ABCA1 aktivitása fordított összefüggést mutatott a habsejtképződéssel, mivel aktivitásának növekedésével a habsejtképződés csökken .
A csökkent vagy károsodott ABCA1 aktivitás okozhat bizonyos betegségeket, mint a 2-es típusú cukorbetegség , a Tangier betegség és a korai CVD .
ABCG1 gén a 21q22.3 kromoszómán található . Mind az ABCA1 , mind az ABCG1 a szöveti koleszterin csökkentéséhez vezet a HDL-be történő efflux révén , de az ABCG1 a szöveti koleszterint a HDL2 és HDL3 , az ABCA1 pedig a lipidmentes Apo A-I felé szállítja . A makrofágok az ABCA1 és az ABCG1 működésének legfontosabb szöveti elemei . Számos tanulmányban vizsgálták e gének fel- és leszabályozásának hatását.
A csökkent koleszterin kiáramlás az ABCA1 expressziójának hiánya in vitro következménye ; ez az ateroszklerózis növekedéséhez vezethet , de az ABCA1 felszabályozása az ateroszklerózis csökkenését eredményezi . Az ABCG1 downregulációja szintén ugyanilyen hatással van a koleszterin effluxra, de ellentmondásosak az eredmények az ABCG1 downregulációjának az ateroszklerózisra gyakorolt hatásáról .
A MetS-ben egyes gének expressziós mintázata megváltozik, és elhízáshoz, cukorbetegséghez és magas vérnyomáshoz vezethet. Jelen tanulmányban az ABCA1 és ABCG1 gének expressziójának értékelését tűztük ki célul MetS-ben szenvedő betegeknél, mivel ezek a gének részt vesznek a transzporterek szintézisében, amelyeknek döntő szerepük van a koleszterintranszportban.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Anyagok és módszerek
2.1. Az ABCA1 és ABCG1 gének expressziójának értékelése. Alanyok
Ezt az eset-kontroll vizsgálatot olyan betegeken végeztük, akiket 2013-2014-ben egy hamadáni (Irán nyugati része) kórház endokrinológiai osztályára utaltak be. Harminchat metabolikus szindrómában szenvedő beteget választottak ki. Emellett kontrollcsoportként 36, korban és nemben illeszkedő egészséges egyént választottak ki. Az egészséges egyének egyike sem felelt meg a metabolikus szindróma kritériumainak.
A metabolikus szindrómás csoportba való bekerülés kritériuma az volt, hogy a fent említett öt jellemzőből hárommal rendelkeztek. A vizsgálatból kizárták azokat a betegeket, akik anamnézisében antilipid, fogamzásgátló és vizelethajtó gyógyszerek fogyasztása szerepelt. A terhes betegeket, valamint a cukorbetegségben, gyulladásban és fertőzésben szenvedő betegeket szintén kizárták.
2.2. A vizsgálatból való kizárás. Vérvétel
Minden alany 2,5 ml vérmintáját EDTA-tartalmú csőbe adtuk, és 4°C-on tartottuk az RNS kivonásig (legfeljebb két órával később).
2.3. Perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC-k)
Lymphodex (Németország) és Henx (Irán) oldatokat használtunk a PBMC izolálásához. Körülbelül 2 ml Henx-oldatot adtunk azonos mennyiségű vérhez, és teljesen elkevertük; majd óvatosan és lassan ráöntöttük 3 ml Lymphodex-oldatra. Ezt követően az elegyet a Lymphodexre helyeztük, és 20 percig 1000 g-nél centrifugáltuk. A plazma és a Lymphodex közötti köztes fehér réteget mononukleáris sejtekként (MC) izoláltuk; majd a Henx-puffert a MC-re adtuk, teljesen összekevertük és centrifugáltuk. Végül a felülúszót elvetettük, és a folyamatot még egyszer megismételtük.
2.4. RNS extrakció és cDNS szintézis
Az RNS nettó extrakcióját a Gene JET RNS tisztító kit segítségével végeztük a gyártó protokolljának megfelelően. A tisztított RNS minőségét és mennyiségét NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA) segítségével elemeztük; majd az egyes RNS-minták integritását 1%-os agaróz gél, 1x TBE segítségével vizsgáltuk.
Az RNS-t RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) segítségével alakítottuk át cDNS-vé a következő protokoll szerint: 1. lépés: primer lágyítás 25°C-on 5 percig; 2. lépés: cDNS-szintézis 42°C-on 60 percig; 3. lépés: hőinaktiválás 70°C-on 5 percig. A termékeket -80°C-on tároltuk a következő lépésekhez.
2.5. Primertervezés
A specifikus primereket az egyes génekhez az Allele ID szoftverrel (7.6-os verzió) terveztük. A valós idejű PCR-reakció specificitásának növelése és a hamis pozitív eredmények csökkentése érdekében minden egyes primerpárból egyet úgy terveztünk, hogy az exon-exon csomópont területéhez kapcsolódjon. Az egyes génekhez használt primerek alapos kritériumait az 1. táblázat tartalmazza. Belső kontrollként a 18S rRNS házőrző gént használtuk.
|
A gének relatív expresszióját az egyes minták küszöbciklus (CT) értékének mérésével számoltuk ki C1000 termocycler és CFX96 valós idejű rendszer (Bio-Rad, USA) és SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa No. RR820L) segítségével. CT-értékként az egyes minták háromszoros vizsgálatának CT-értékének átlagát határoztuk meg. A qRT-PCR-reakció hozzávaló mennyiségei 10 μL SYBR zöldet, 7 μL ionmentesített vizet és 1 μL-t tartalmaztak a forward primerből, a reverz primerből és a templátból. A qRT-PCR-t a következő körülmények között végeztük: kezdeti aktiválás 95°C-on 30 másodpercig, majd 40 ciklust ismételtünk a következő lépésekből: denaturálás 95°C-on 5 másodpercig, lágyítás az egyes gének megfelelő időtartamára optimalizált lágyítási hőmérsékleten, majd hosszabbítás 72°C-on 30 másodpercig, a végén pedig a hőmérséklet 72°C-ról 95°C-ra történő növelésével 0,5°C/0,05 másodpercig nyertük az adatokat. Ezután a PCR-termékeket elektroforizáltuk (1%-os agaróz gélen, 1x TBE) az amplikonok specificitásának ellenőrzésére.
2.6. A szérum biokémiai tényezőinek értékelése
Minden alanyból kétmilliliteres vérmintát vettek, és a szérum elkülönítéséhez 10 percig 3000 rpm-en centrifugálták. Az összkoleszterint (TC), az LDL-C-t, a TG-t, az FBS-t és a HDL-C-t a Hitachi 911 (Németország) Pars Azmun (Irán) kit segítségével vizsgáltuk.
2.7. Elemzés és az eredmények értelmezése
képletet használtunk a metabolikus szindróma és a kontrollcsoportok relatív génexpressziójának elemzéséhez. A valós idejű PCR hatékonyságát minden gén esetében 10-2 hígítással számoltuk ki; ezt követően a kapott számot a következő számítási képletre helyeztük a génexpresszió hajtásváltozásának mérésére :SPSS V.16 szoftvert használtunk a statisztikai elemzéshez 95%-os konfidenciaintervallummal. A változók normális eloszlását Kolmogorov-Smirnov módszerrel ellenőriztük, majd az értékeket független minták -próbával hasonlítottuk össze két csoport között.
3. Eredmény
A vizsgált csoportok demográfiai jellemzőit és biokémiai tényezőit a 2. táblázat tartalmazza. A férfi/nő arány mindkét csoportban 1/3 volt (12 M és 24 F). Amint a 2. táblázatban látható, az életkor és az LDL-C kivételével minden vizsgált paraméterben statisztikailag szignifikáns különbségek voltak a két csoport között (). A metabolikus szindrómás csoportban magasabb volt a BMI, az LDL-C, a TC, a TG, az FBS, a diasztolés/diasztolés vérnyomás és a derékkörfogat az egészségesekhez képest, míg a HDL-C szignifikánsan alacsonyabb volt a metabolikus szindrómásoknál.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BMI: testtömegindex; FBS: gyors vércukor; TG: triglicerid, HDL-C: nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin; LDL-C: kis sűrűségű lipoprotein-koleszterin; jelentős különbség. |
3.1. táblázat. A qRT-PCR eredményei
A PCR-reakció befejezése után az eredményeket a reakciógörbe, a termékek olvadási görbéjének és a PCR-termékek elektroforézisének elemzésével ellenőriztük. Az elektroforézist 1%-os agarózon végeztük 100 bp-os DNS-vezető segítségével. Az eredményeket az 1. ábra mutatja.
3.2. A génexpresszió értékelése a PBMC-ben
A gének expressziós szintjét megmértük a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben, és összehasonlítottuk a két csoportot az egyes génekre vonatkozó ΔCT kiszámításával. Az ABCA1 expressziójában nem volt különbség a két csoport között, de az ABCG1 expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a MetS-csoportban (). A részletes eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.
|
||||||||||||||||||||||||||
Jelentős. |
Az ABCG1 expressziójában bekövetkezett hajtásváltozás számítása () szintén 3,1-szer alacsonyabb expressziót jelzett a MetS csoportban.
4. Megbeszélés
ABCA1 és ABCG1 döntő szerepet játszik a koleszterin reverz transzportjában a perifériás szövetekből, például a makrofágokból a májba . Az ABCA1 és ABCG1 gének expresszióját azonban néhány betegségben tanulmányozták; a metabolikus szindróma esetében nem találtunk erről a témáról beszámolót. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk ezeknek a géneknek az expresszióját metabolikus szindrómás és egészséges egyénekben.
Míg az ABCA1 gén expressziójában nem volt szignifikáns különbség a két vizsgált csoport között, az ABCG1 szignifikánsan alacsonyabb expresszióját (kb. 75%) találtuk a metabolikus szindrómás alanyokban a kontrollcsoporthoz képest. Singaraja és munkatársai kimutatták, hogy a csökkent ABCA1 a makrofágokban és a vesékben fokozott koleszterintartalommal jár együtt . Arra a következtetésre jutottak, hogy a károsodott ABCA1 által közvetített koleszterin export hozzájárulhat a cukorbetegséggel járó fokozott érelmeszesedéshez és nefropátiához . Néhány jelentés megpróbál foglalkozni az e gének kifejeződését szabályozó lehetséges mechanizmusokkal. A közelmúltban kimutatták, hogy az ABCA1 és az ABCC8 polimorfizmusai összefüggésbe hozhatók a metabolikus szindrómával . Bizonyított, hogy az ABCA1 működésének zavara, amely e gén mutációjának eredménye lehet, familiáris hipoalkalipoproteinémiához vezethet, amelyet alacsony HDL-érték és a koleszteril-észterek fokozott lerakódása jellemez számos szövetben és sejtben . Azt is kimutatták, hogy az ABCA1 gén túlexpressziója védelmet nyújthat az ateroszklerózis ellen . Ezek az adatok összhangban vannak a mi eredményeinkkel, és alátámasztják ezt az elképzelést, hogy az ABCA1 gén alacsonyabb expressziója hozzájárulhat a metabolikus szindróma szövődményeihez.
Haghpassand et al. kimutatták, hogy az ABCA1 gén expressziója a PBMC-kben közvetlen kapcsolatban van a koleszterin terheléssel, és az ABCA1 túlterjedése a felesleges koleszterin apoproteinekre történő átviteléhez vezet . Wang és munkatársai tanulmányozták a fordított koleszterin transzportot ABCA1 és ABCG1 knockdown egerekben, és arra a következtetésre jutottak, hogy amikor mind az ABCA1, mind az ABCG1 kiütötték, nagyobb a fordított koleszterin transzport, mint az ABCG1 kiütött .
Mivel Mauerer és munkatársai rámutattak, hogy a magas glükózszint (hiperglikémia) részt vesz a csökkent ABCA1 és ABCG1 expresszióban in vitro , logikusnak tűnik, hogy hasonló változásokra számíthatunk MetS-ben. Az ABCA1 és ABCG1 promóterei az LXR és az RXR receptorhelyével rendelkeznek; amikor az oxikoleszterin és a retinsav csatlakozik ezekhez a faktorokhoz, az ABCA1 és ABCG1 expressziója megnő. Emellett a cAMP és az NFκB az ABCA1, illetve az ABCG1 transzkripciós faktorai.
A kapott eredmények az ABCG1 expressziójának jelentős csökkenését jelezték a metabolikus szindrómás betegeknél az egészségesekhez képest. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a transzporterkapacitást meghaladó hiperglikémia, a kapcsolódó metabolitok és a hiperlipidémia az ABCG1 csökkent expressziójához vezethet. Mivel az ABCA1 génexpressziójában nem észleltek szignifikáns változást, ez más szabályozási mechanizmusra vezethető vissza. Mivel ezeknek a géneknek a szerkezete eltérő, és különböző transzkripciós faktorok szabályozzák őket, eredményeink igazolhatóak . Mindazonáltal a korlátozott számú minta ebben a vizsgálatban egy másik tényező az ABCA1 expressziójában bekövetkezett változások elmaradásában.
A másik pont az, hogy ezeknek a géneknek az expresszióját a vizsgált személyek PBMC-jében vizsgáltuk; fontos megjegyezni, hogy ezen gének expressziójának változása a monocitákban más lehet, mint a többi kulcsfontosságú szövetben, például a májban és a bélben, amelyek a HDL-szintézis fő helyszínei. Továbbá az mRNS-szintek változásai nem feltétlenül jelentenek változásokat a kapcsolódó fehérjékben.
Érdekütközés
A szerzők kijelentik, hogy nincs érdekellentét.
A köszönetnyilvánítás
Ez a tanulmány Zahra Tavoosi diplomamunkájából származik. A szerzők köszönetet mondanak a Hamadáni Orvostudományi Egyetemnek a tanulmány anyagi támogatásáért.