APEI elősegíti a gyengén horgonyzó sejtek és primer szövetek kötődését
A PC-12 sejteket a neuronális differenciáció modelljeként használják a laboratóriumban, mivel e sejtek idegnövekedési faktorral (NGF) történő kezelése neuritnyúlást és a szimpatikus neuronális fenotípus biokémiai markereinek kifejeződését indukálja. Gyengén horgonyzó sejtekként növekednek, és gyakran használnak kollagén- vagy polilizin-polimereket a PC-12 sejtkultúrához használt lemezek előbevonására . A PC-12 sejteket laboratóriumban naiv lyukakban vagy különböző kötődési faktorokkal előzetesen bevont lyukakban (multiwell-12 szövettenyésztő edények) tenyésztették, hogy megfigyeljék a sejteknek a szubsztrátumhoz való rögzülésére gyakorolt hatását. Bármilyen bevonóanyag hiányában a sejtek jellegzetes tendenciát mutattak arra, hogy a kút közepe felé halmozódó sejtklasztereket képeznek; ezek a sejtek egymáshoz szilárdan kapcsolódnak, de nagyon gyengén kötődnek a szövettenyésztő tálhoz (1D ábra). Ez a sejtek nagyon heterogén eloszlását eredményezi (nagyon kevés sejt marad a lyukak széle felé), és jelentős sejtveszteséget okoz a mosási eljárások vagy a közegcsere során. A tányérok PEI-vel történő előkezelése a sejtek lényegesen homogénebb eloszlását eredményezte a lyukakban, a sejtek szilárdan rögzültek a tányérhoz, és sokkal kisebb volt a klaszteresedésre való hajlam (1A. ábra). Összehasonlításképpen a lemezeket más általánosan használt bevonószerekkel, kollagénnel (1B. ábra) és poli-D-lizinnel (PDL; 1C. ábra) is előkezelték, ami szintén a sejtek szilárdabb rögzülését eredményezte a lemezekhez és a sejtek homogénebb eloszlását.
PC-12 sejtek és neuronális explantátumok rögzítése a tenyésztőedényekhez. A PC-12 sejtek jobban rögzültek a lehorgonyzást elősegítő faktorokkal, például PEI-vel (A panel), kollagénnel (B panel) vagy PDL-lel (C panel) előkezelt műanyag felületekre, mint a kezeletlen műanyag felület kontrolljára (D panel), ahol a sejtek csomókban voltak és nagyon lazán kapcsolódtak a szubsztrátumhoz (a képek a lemez közepe és széle között félúton készültek). A PEI bevonat a tányér szubsztrátumához szilárdan rögzült sejtek homogén eloszlását eredményezte (A panel). A PEI elősegíti a zebrahalból származó retina-explantátumok tenyészcsészékhez való rögzülését (E panel). Ez a kötődési faktor támogatta a neuritok kiterjedését a látóideg előkondicionáló sérülésével axonális növekedésre előkészített retinális explantátumokban (F panel). A fotómikroszkópiákon a sáv az A-D panelekben 25 μm-nek, az E panelben 50 μm-nek, az F panelben pedig 100 μm-nek felel meg.
A tenyésztőedények PEI előkezelésével megfigyelt rögzítést fokozó tulajdonság további teszteléséhez egy második rendszert használtunk. Teleost halakból származó retina-explantátumokat használtak az idegek regenerációjának tanulmányozására . Amikor a halak látóidegét sérülés éri, regenerációs válasz indul be, és a retina retinális ganglionsejtjei (RGC-k) újra meghosszabbítják axonjukat a tektális célszövet felé. Ha egy ilyen “előkészített” hal retináját kiültetjük és tenyésztjük, a regenerációs válasz in vitro a hosszú neuriták felgyorsult meghosszabbodásával figyelhető meg. Ez a jelenség azonban extracelluláris mátrix vagy kötődési faktorok (például kollagén vagy PDL bevonat) alkalmazását igényli, mivel az explantátumok nagyon alacsony affinitást mutatnak a bevonat nélküli műanyag felülethez. Kísérleteket végeztünk annak megfigyelésére, hogy a PEI képes-e olyan kötődési faktorként működni, amely elősegíti az axonok kinövését a zebrahal retina-explantátumokból. A kontroll zebrahal szemekből származó retinális explantátumok képesek voltak a PEI-vel előkezelt tenyészcsészékhez rögzülni (1E ábra). Továbbá, a kondicionáló sérülést kapott halakból származó retina-explémák képesek voltak erőteljesen kinyújtani az axonokat, amikor PEI-t használtak kötőfaktorként (1F ábra).
A retina-explémákkal kapott eredmények azt sugallták, hogy a PEI-vel bevont tányérokhoz rögzített neuronális sejtek képesek differenciálódni, és olyan neuritokat létrehozni, amelyek jól kötődnek a szubsztrátumhoz. E hipotézis tesztelésére a proneuronális PC-12 sejtekkel NGF-kezeléssel differenciálódási kísérleteket végeztünk PEI-vel bevont tányérokra rögzített sejtekkel. Az NGF-fel kezelt PC-12 sejtek több napon keresztül szilárdan rögzültek a tányérhoz, és neuritok hálózatát hozták létre (2. ábra). Az eredmények azt jelzik, hogy a PEI lehetővé teszi a differenciálódási folyamatot és a neuriták tányérhoz való rögzülését. A differenciált sejtek az immuncitokémiai kísérletek során végig szilárdan rögzítve maradtak (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García és R. P. Ballestero, publikálatlan eredmények).
PÉI-vel bevont tenyészcsészére rögzített PC-12 sejtek differenciálódása. A PEI-vel bevont tányérokra rögzített PC-12 sejtek szilárdan rögzültek a tányérhoz, és NGF-kezelés hatására neuritokat növesztettek. A képek a kezelt sejtek differenciálódásának időbeli előrehaladását mutatják: 0 óra (A panel), 24 óra (B panel), 48 óra (C panel) és 96 óra (D panel) a 100 ng/ml NGF-fel történő kezelés megkezdése után. A fotómikroszkópiákon a sáv 25 μm-nek felel meg.
Eukarióta sejtek PEI-vel és más kötődési faktorokkal előkezelt tenyészedényekhez való rögzítésének erőssége
Három különböző sejtvonalat választottunk ki annak vizsgálatára, hogy a PEI képes-e elősegíteni a műanyag tenyészedényekhez való erős rögzítést. A PC-12 és HEK-293 sejteket a fentiekben gyengén horgonyzónak írtuk le. Ezzel szemben a MYS sejtek olyan primer fibroblasztok, amelyek erősen tapadnak a műanyag tenyészedényekhez, és a felszínen monoréteggé nőnek. A különböző sejtek lemezekhez való rögzülésének erősségének vizsgálatára olyan protokollt végeztünk, amelyben 4 egymást követő mosást végeztünk izotóniás pufferrel, majd egy kolorimetriás protokollt alkalmaztunk a lemezen maradt sejtek megszámlálására (a semleges vörös vitális festék alapján). A különböző kötődési faktorokkal előkezelt lemezeket olyan lemezekkel hasonlítottuk össze, amelyek nem kaptak előkezelést (kezeletlenek). A kísérleteket három példányban végeztük, és kiszámítottuk az egyes kezelésekben részesült lemezeken visszamaradt festék átlagát. Ezeket az átlagokat a PEI előkezeléssel kapott átlaghoz normalizáltuk, amelyhez minden kísérletben a 100,0%-os önkényes értéket rendeltük. A 3 sejtvonallal végzett reprezentatív kísérletek eredményeit a 3. ábra mutatja (minden sejtvonallal legalább három független kísérletet végeztünk). A PC-12 sejtek szinte egyformán jól kapcsolódtak a PEI-vel, kollagénnel vagy PDL-lel bevont lemezekhez (a relatív sejtszám 100,0% ± 5,3%, 89,3% ± 5,0% és 96,3% ± 5,8% volt a PEI, kollagén és PDL esetében). A kezeletlen lemezek és a PEI-vel előkezelt lemezek összehasonlításakor azonban jelentős sejtvesztés volt megfigyelhető, a relatív sejtszám 43,9% ± 5,8% volt (3A. ábra). A HEK-293 esetében a sejtek erősen tapadtak mind a PEI-vel, mind a PDL-lel előkezelt lyukakhoz. A 3B. ábrán látható reprezentatív kísérletben a relatív sejtszám e két kezeléssel 100,0% ± 0,4%, illetve 96,8% ± 1,7% volt. A kezeletlen kutakba (8,3% ± 0,6% relatív szám), illetve a kollagénnel előkezelt kutakba (11,5% ± 1,2%) telepítve azonban nagyszámú sejt veszett el, ami arra utal, hogy ezek a sejtek meglehetősen lazán tapadnak a műanyaghoz vagy a kollagénnel bevont kutakhoz. Végül, amikor a fibroblaszt sejteket (MYS sejtek) használtuk, úgy tűnt, hogy a sejtek meglehetősen jól tapadnak mind a négy felülethez, beleértve a kezeletlen kutakat is (3C. ábra). A 3C. ábra egy reprezentatív ábrát mutat, amely 100,0% ± 2,2%, 85,9% ± 7,8%, 73,7% ± 6,6% és 77,1% ± 1,4% relatív MYS sejtszámot mutat a PEI-vel, kollagénnel vagy PDL-lel előkezelt kutakkal, illetve a kezeletlen kutakkal. Ez a sejtvonal tehát a PC-12 és HEK-293 sejtvonalakkal összehasonlítva meglehetősen jól kötődik a kezeletlen műanyag felülethez.
A PEI bevonat elősegíti a gyengén horgonyzó sejtek szilárd rögzülését az aljzathoz. A sejtek többszöri mosással járó protokoll által kiváltott sejtveszteséget mértük, hogy felmérjük, milyen erősen kötődnek a sejtek a sejtek lehorgonyzását elősegítő faktorokkal bevont tenyésztőedényekhez. A PEI-t más kötődési faktorokkal (kollagén, PDL) és kezeletlen kontroll edényekkel hasonlítottuk össze. A relatív sejtszámot úgy normalizáltuk, hogy a PEI-vel előkezelt edényekhez 100,0%-os önkényes értéket rendeltünk. A PEI bevonat a PC-12 sejtek (A. ábra) és a HEK-293 sejtek (B. ábra) esetében a rögzítési szilárdság jelentős fokozódását eredményezte, kedvezően összehasonlítva más, általánosan használt rögzítő faktorokkal. Egy erősen horgonyzó sejtvonal (MYS sejtek, C ábra) rögzítésében nem tapasztaltunk előnyöket. A sávok háromszoros vizsgálatok átlagát ± standard eltérést mutatják, amelyek legalább három különböző elvégzett kísérletet reprezentálnak (* szignifikánsan magasabb, mint a kezeletlen kontroll, p < 0,01; ** szignifikánsan magasabb, mint a kezeletlen kontroll a bemutatott kísérletben, p < 0,01, de a szignifikancia független kísérletekben nem maradt fenn).
A kísérletek közötti eltérések jelzésére a független kísérletek során kapott relatív sejtszámok átlagait ± standard eltéréseket számoltuk ki minden egyes sejtvonalra és kezelésre (megjegyezzük, hogy mivel minden kísérletben a PEI-vel előkezelt kutak esetében a számot 100,0%-ra állítottuk be, a globális átlag értéke ezzel a bevonószerrel az összes sejtvonal esetében pontosan 100,0%). A többi kezelésre vonatkozó összehasonlító eredmények az alábbiakban jelennek meg. A PC-12 sejtek esetében a relatív szám 81,5% ± 8,8% volt a kollagénnel előkezelt kutak esetében (n = 4), 93,9% ± 21,2% a PDL-lel előkezelt kutak esetében (n = 4) és 52,1% ± 13,7% a kezeletlen kutak esetében (n = 4). A HEK-293 sejtek esetében a relatív számok 16,3% ± 12,7% voltak a kollagénnel előkezelt kutaknál (n = 3), 99,6% ± 2,5% a PDL-lel előkezelt kutaknál (n = 3) és 9,0% ± 4,1% a kezeletlen kutaknál (n = 3). A MYS sejtekkel végzett kísérletekben a relatív számok átlaga a kollagénnel előkezelt kutaknál 92,7% ± 16,2% (n = 3), a PDL-lel előkezelt kutaknál 71,1% ± 6,7% (n = 3) és a kezeletlen kutaknál 78,4% ± 11,5% (n = 3) volt. A statisztikai elemzés azt mutatja, hogy mind a PC-12, mind a HEK-293 sejtek adhéziójának fokozódása a PEI-vel előkezelt edényekhez képest a kezeletlen műanyaghoz képest szignifikáns (p < 0,05 és p < 0,01, t-teszt elemzés), míg a MYS sejtek esetében ez statisztikailag nem szignifikáns (p > 0,05).
A PEI mint a gyengén horgonyzó sejtek kötődési tényezőjének tulajdonságainak további jellemzése érdekében kísérleteket végeztünk annak elemzésére, hogy a PEI milyen dózisban képes optimális sejthorgonyzást biztosítani, milyen sejtszám-tartományban lehet előnyös a PEI jelenléte, és milyen a PEI mint kötődési tényező stabilitása. A 4A. ábra egy reprezentatív kísérlet eredményeit mutatja, amely a HEK-293 sejtek különböző dózisú PEI-vel bevont tányérokra történő rögzítésének erősségét vizsgálta. A sejtek számát a 25 μg/ml PEI-vel történő kezelés során kapott értékre normalizáltuk, amelyet 100,0%-ra állítottunk be. Az eredmények azt mutatják, hogy a 2,5 μg/ml vagy magasabb PEI-koncentráció maximális kötődésfokozódást eredményezett, ami arra utal, hogy a műanyag tál felületét ezeknél a koncentrációknál teljesen bevonja a polimer. A polimer magasabb koncentrációi nem tűntek toxikus hatásúnak a sejtekre, ha az oldatban maradt PEI feleslegét alaposan eltávolítottuk (enyhe toxikus hatást figyeltünk meg a 250 μg/ml koncentrációnál, ha a kezelés után nem távolítottuk el teljesen az oldatot). Az ábrázolt kísérlet 4 független kísérlet reprezentatívja. A 4B. ábra a PC-12 és HEK-293 sejtek különböző számával kapott eredményeket mutatja be. Az ábra a relatív sejtszámokat mutatja, ahol a 100,0%-os önkényes értéket a PEI-vel kezelt kutakból kapott átlagos számhoz rendeltük, ahol az egyes sejtvonalak legnagyobb száma volt (3,2 × 105 HEK-293 sejt és 1,5 × 106 PC-12 sejt). Az eredmények azt mutatják, hogy a PEI mind a PC-12, mind a HEK-293 sejtek esetében a sejtek számának széles tartományában jól működött kötődési faktorként. Alacsonyabb sejtszámokat nem lehetett megbízhatóan vizsgálni, mert azok közel voltak a semleges vörös teszt érzékenységi határához. A bemutatott eredmények az egyes sejtvonalakkal végzett legalább 4 független kísérlet reprezentatív eredményei. A 4C. ábra a PEI mint kötődési tényező stabilitásának vizsgálatára végzett kísérlet eredményeit mutatja. Ebben a kísérletben egy sor lemezt PEI-vel kezeltünk, majd PBS-ben tartottuk 4°C-on 10 napig. Egy második vizsgálatban a lemezeket PEI-vel kezelték, majd 3 napig tartották (táptalajjal) 37°C-os CO2 inkubátorban, 24 óránként táptalajcserével. A PEI teljesítményét ezeken a lemezeken ezután összehasonlították a PEI-vel kezelt lemezekkel a korábbi kísérleteknél leírt standard protokoll szerint. Az eredmények a relatív sejtszámot a standard PEI-vel kezelt lemezeken kapott abszorbanciák átlagára normalizálva mutatják, amely a 100,0%-os önkényes értéket kapta. Az eredmények azt mutatják, hogy a PEI-bevonat legalább 10 napig stabilan megmarad a műanyag tányér felületén a hűtés után, és nem távolítja el a 37 °C-on, tápfolyadékban történő inkubálás vagy akár ismételt tápfolyadékcserék hatására sem. Az eredmények 4 független, három példányban végzett kísérlet reprezentatív eredményei.
A PEI mint kötődési tényező tulajdonságainak jellemzése. A. ábra: A PEI növekvő dózisát vizsgáltuk az optimális bevonathoz szükséges koncentrációtartomány meghatározásához. A PEI 2,5 μg/ml és magasabb koncentrációknál teljes kötődésfokozást mutatott. B. ábra: A PEI elősegítette mind a PC-12, mind a HEK-293 sejtek kötődését a sejtek számának széles tartományában (a tesztelt számok az X tengelyen vannak feltüntetve). C. ábra: A PEI bevonat stabil maradt a tenyésztőedény felszínén hosszú inkubációs időszakok és táptalajcserék során (10d-PBS: PEI-vel kezelt tál 10 napig inkubálták PBS-ben 4°C-on; 96 h-3MC: PEI-vel kezelt tál 96 órán át inkubálták 3 táptalajcserével 37°C-on). Minden grafikon esetében a sávok háromszoros vizsgálatok átlagát ± standard eltérést mutatják, amelyek legalább 3 független kísérletet reprezentálnak (* szignifikánsan magasabb, mint a kezeletlen kontroll, p < 0,01).
APEI előkezelés fokozza a gyengén lehorgonyzó sejtek lipofekcióját
Az eukarióta sejtek lipofekcióval történő transzfekciója több lépést, médium hozzáadását és cseréjét jelenti, ami a gyengén lehorgonyzó sejteknél megterhelő lehet. Még ha ügyelnek is a sejtveszteség elkerülésére, a gyengén lehorgonyzott sejtek kevésbé hatékonyak lehetnek a transzfekciós komplexek felvételében. Mivel a sejttenyésztő edények PEI előkezelése növelte a sejtek ilyen felületekhez való kötődésének erősségét, feltételeztük, hogy a kötődési tényezőnek pozitív hatása lehet a lipofekcióval elért transzfekciós hozamra. A fent leírt három sejtvonalat használtuk e hipotézis tesztelésére a korábban vizsgált bevonószereket alkalmazva. A transzfekciókat a β-galaktozidáz riporterenzimet kódoló plazmiddal végeztük. A transzfekciós hozamot a transzfektált sejtekből származó lizátokban a riporterenzim aktivitásának meghatározásával követtük nyomon. Minden sejtvonallal legalább két független vizsgálatot végeztünk három példányban. A reprezentatív ábrák az 5. ábrán láthatók. A hozamokat (β-galaktozidáz aktivitásokat) a PEI előbevonattal kapott aktivitáshoz normalizáltuk, amelyet referenciaként 100,0%-ra állítottunk be. Általánosságban megfigyelhető volt, hogy a gyengén horgonyzó sejteknél a transzfekciós hozamok javultak a sejtek lemezhez való rögzülését elősegítő hatóanyagokkal történő előbevonattal. A PC-12 sejtek esetében a furatok PEI-vel, kollagénnel vagy PDL-lel történő előbevonása a kezeletlen furatokhoz képest 2-3-szoros transzfekciós hozamnövekedést eredményezett: a PEI esetében 100,0% ± 1,4%, a kollagén esetében 87,0% ± 8,7% és a PDL esetében 100,1% ± 2,4%, míg a kezeletlen furatok esetében 42,9% ± 2,2% (5A. ábra). A transzfekciós hozam javulása a PEI előkezeléssel a HEK-293 sejtek esetében még kifejezettebb volt. Az 5B. ábrán látható kísérlet 21,1% ± 3,4%-os relatív aktivitást mutat a kezeletlen kutakban lévő sejtek esetében, szemben a PEI-vel előkezelt kutak 100,0% ± 8,4%-ával (körülbelül ötszörös növekedés). A kollagénnel vagy PDL-lel történő előkezelés szerényebb indukciót eredményezett (kb. 2-3-szoros az 5B ábrán). A legalacsonyabb javulást kollagénnel figyeltük meg, hasonlóan a HEK-293 sejtek kötődésének korábban a 3B. ábrán megfigyelt alacsonyabb fokozódásához. Végül, az erősen kötődő MYS fibroblasztok esetében nem volt megfigyelhető jelentős pozitív hatás a kötődési faktorok transzfekciós eljárás során történő alkalmazásával. Az eltérések általában 20%-nál kisebbek voltak minden kísérleti körülmény esetében. Az 5C. ábrán látható reprezentatív kísérlet valójában azt mutatja, hogy a kezeletlen kutak transzfekciós hozama valamivel magasabb volt, mint a PEI-vel előkezelt lemezeké (a relatív aktivitás 117,7% ± 3,2% a kezeletlen kutak esetében, szemben a 100,0% ± 4.8% a PEI-vel előkezelt kutak esetében, vagyis körülbelül 1,2-szer nagyobb transzfekciós hozam a kontrollnál).
APEI fokozza a gyengén horgonyzó sejtek transzfekcióját. A transzfekciós hozamokat β-galaktozidáz-mérésekkel határoztuk meg, és a tenyésztőedény PEI bevonásával kapott hozamokhoz normalizáltuk (amelyhez 100,0%-os önkényes értéket rendeltünk). A PEI és más kötődési faktorok fokozták a lazán kötődő sejtvonalak, például a PC-12 sejtek (A ábra) és a HEK-293 sejtek (B ábra) transzfekcióját. A szorosan kötődő sejteknél, például a MYS fibroblasztoknál nem volt jelentős hatás (C ábra). A sávok háromszoros vizsgálatok átlagát ± standard eltérést mutatják, amelyek legalább két független kísérletre reprezentatívak (* szignifikánsan magasabb, mint a kezeletlen kontroll, p < 0,01).
Az összes elvégzett kísérlet eredményeit összesítve a PEI-re lehorgonyzott PC-12 sejtek transzfekciós hozamában megfigyelt átlagos (± standard eltérés) duplázódás (2) volt a kezeletlen kutakon lévő sejtekhez képest.4-szeres (± 0,1-szeres; n = 3), míg a HEK-293 sejtek esetében a fokozás 6,3-szoros (± 0,5-szeres; n = 2) volt. t-próbás statisztikai elemzés szerint mindkét növekedés szignifikáns (p < 0,05). A MYS sejtekkel végzett kísérletek során nem tapasztaltunk szignifikáns transzfekciós fokozódást, a PEI-vel történő előkezelés hatására átlagosan 1,0-szeres (± 0,3-szoros; n = 2) volt a transzfekció (lényegében azonos a kezelés nélküli hozammal).