A RNS-termelő DNS-hidrogél, mint egy nagy teljesítményű RNS-interferencia rendszer platformja

Az I-gél szintézise és jellemzése

A négy X-DNS oligonukleotidot (X01-X04 DNS-szálak) az Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA) kereskedelmi forgalomban szintetizálta. Az X-DNS-szekvenciákat (5. kiegészítő táblázat) az irodalomban leírt eljárások szerint terveztük, állítottuk elő és jellemeztük, enyhe módosításokkal10,13 . A liofilizált DNS-szálakat 1 μmolos méretben 14 000 g-nél 15 másodpercig tartó, szobahőmérsékleten végzett centrifugálással gyűjtöttük össze. Minden egyes DNS-szálat 1x TE pufferben (pH 8,0) 1,0 mM koncentrációra reszuszpendáltunk. Minden egyes csövet a MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) segítségével 1500 rpm-en ráztattunk és kevertünk ~3 órán keresztül a liofilizált oligonukleotidok teljes feloldása érdekében. Összesen 0,05 μmol (50 μl) minden egyes DNS-szálból egy 1,5 ml-es csőben egyesítettünk, és nukleázmentes vizet adtunk hozzá, az oligonukleotid-keverék teljes térfogatát 500 μl-re növelve. 100 μl oligonukleotid-keveréket 0,5 ml-es csövekbe osztottunk. A csöveket termocyclerbe (Bio-Rad, CA, USA) helyeztük. A négyféle oligonukleotidot (X01 ~04) a következő körülmények között lágyítottuk: kezdeti denaturáció 95 °C-on 10 percig; majd 65 °C-on 2 percig, 60 °C-on 5,5 percig, 1 °C-kal csökkentve, 1 percig ezen a hőmérsékleten tartva, 20 °C-on 30 s-ig, majd 4 °C-ra csökkentve az X-DNS stabilizálása és tárolása céljából. Ezután a puffercseréhez a mikrocentrifugáláshoz használt szűrőegységben (3 kDa Mw cutoff) a lágyított X-DNS-oldatot (500 μl) 6 órán keresztül 15 000 g-n és 4 °C-on centrifugáltuk az oldószer térfogatának csökkentése érdekében. A szűrőegységet friss centrifugacsőbe helyeztük át. Összesen 100 μl kb. 4 °C-os nukleázmentes vizet adtunk a szűrőegységhez. A szűrőegységet 4 órán át 15 000 g-n és 4 °C-on centrifugáltuk, hogy az X-DNS-t kiöblítsük a maradék sóktól. A levágott szűrőegységet fejjel lefelé fordítva kellett a csőbe helyezni, és 2000 g-nél 3 percig 4 °C-on centrifugálni. A nukleázmentes víz hozzáadását és a centrifugálást még kétszer végeztük el ugyanabban a centrifugacsőben az X-DNS maradék sóinak teljes eltávolítása érdekében. Az X-DNS-oldat végső térfogata ~300 μl lesz. Az siRNS-expressziós plazmidot (I-plazmid) a Cosmo Genetech (Szöul, Dél-Korea) vásárolta és állította elő maximálisan. Az I-gélek konstruálásához az I-plazmidokat a BamHI restrikciós enzim segítségével linearizáltuk. Az siRNS-gén mérete 66 bp volt a spacerrel együtt (vagy 498 bp a T7 promóterrel) (az I-plazmid térképét lásd a 4. kiegészítő ábrán). A minták DNS-mennyiségét az UV/Vis abszorpciós értékük alapján határoztuk meg BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburg, Németország) segítségével. Az X-DNS-t és a lineáris plazmidokat először T4 DNS-ligáz (Promega, Madison, WI, USA) jelenlétében előre meghatározott mólarányban összekevertük a Dgel szintéziséhez. Az 1500:1 X-DNS:I-plazmid arányhoz 10,5 μL 75 μM X-DNS-t és 5,25 μL 100 nM plazmidot használtunk 30 μL reakciótérfogatban. A Blank-gél kísérlethez ugyanannyi X-DNS anyagot ligáltunk T4 DNS-ligázzal, mint az I-gélben. Minden mintából 10 μL-t 2 μL gélbetöltő pufferrel kevertünk össze, és 0,7 vagy 2%-os agaróz gélen 100 V-on 60 percig elektroforizáltuk. Minden DNS-t (X-DNS, I-plazmid, Blank-gél és I-gél) agaróz gélelektroforézissel igazoltunk (3., 11., 18. kiegészítő ábra). A szintetizált D-géleket kétszer sótalanítottuk Amicon 3 kDa Mw cutoff mikrotubuláris centrifugális szűrőkkel. A pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képalkotáshoz a mintákat FreeZone fagyasztva szárítóban (Labconco, Kansas City, MO, USA) fagyasztva szárítottuk, amíg az összes vizet el nem távolítottuk. A szárított mintákat feltörtük, hogy láthatóvá váljon friss felületük. Miután 100 másodpercig 2~ 3 nm-es Pt-réteggel porlasztással bevontuk, ezen hidrogél felületek morfológiáját ~50 000× nagyítással megfigyeltük egy S-3500N (Hitachi, Tokyo, Japán) pásztázó elektronmikroszkóp segítségével 15 kV-os gyorsítófeszültség mellett (19. kiegészítő ábra).

I-gél stabilitási teszt

Hét mintát készítettünk a szabad I-plasmidból és az I-gélből. Minden mintában 2 µL szabad I-plazmidot (57 ng) vagy I-gélt (1:1500 gél, amely 57 ng I-plazmidot tartalmazott) 12 µL desztillált vízben hígítottunk, majd 4 µL 5 × pufferrel optimalizált transzkripciót adtunk hozzá, és 3,33 × 10-5 egység DNáz I-vel (M6101 sz.; Promega) kezeltük 20 µL végső térfogatig, majd 37 °C-on inkubáltuk 0, 1, 4, 4, 12, 24 és 48 órán keresztül. Az inkubációt követően a 20 µl-es mintákat két 10 µl-es aliquotra osztottuk, az egyiket az elektroforézishez, a másikat pedig a következő transzkripcióhoz. Mindkét aliquotban a denaturációs reakciót 1 µL RQ1 DNáz-stop oldat hozzáadásával és 10 perces 65 °C-on történő inkubálással fejeztük be. Ezt követően minden mintából 10 µl-t 2 µl gélbetöltő pufferrel kevertünk össze, és 2%-os agaróz gélen 100 V-on 60 percig elektroforizáltuk (13. kiegészítő ábra). Minden mintából egy másik aliquotot használtunk a transzkripciós reakcióhoz, hogy demonstráljuk az I-gél transzkripciós hatékonyságát az emésztési reakció után. A shRNS-eket az I-gélből vagy a szabad I-plazmid sablonokból (0, 24, 48 h) transzkripciós kit (Riboprobe; Promega) segítségével a gyártó utasításait követve írtuk át. A kapott shRNS-eket RT-qPCR segítségével számszerűsítettük a Total RNS előkészítése és reverz transzkripció, valamint a Real-time PCR és adatelemzés fejezetekben leírtak szerint (4. kiegészítő táblázat).

A fehérjék expressziójának és gátlásának elemzése

A kapcsolt transzkripciós és transzlációs kiteket (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, katalógusszám: 88882) a Thermo Fisher Scientific-től (Waltham, MA, USA) vásároltuk, és a reakciókat a gyártó által javasolt eljárások szerint végeztük. Röviden, a HeLa sejt lizátumot, a járulékos fehérjéket, a reakciómixet és a pcDNA3.1( + ) IRES GFP plazmidot (0,5 μg/μL; No. 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) 12,5:2 arányban kevertük.5:5:2 (v/v) arányban kevertük, és 30 °C-on inkubáltuk 1, 2, 4 és 6 órán keresztül. A megadott reakcióidők után a mintaoldatokat 24 órán keresztül 4 °C-on inkubáltuk, hogy mind a reakciót leállítsuk, mind pedig a fehérjék elegendő időre történő hajtogatását biztosítsuk. Az interferencia hatékonyságának értékeléséhez 1000 ng GFP plazmid jelenlétében szabad I-plazmidot vagy I-gélt adtunk a sejtlizátumhoz. Az 57 ng I-plazmidot (17,5 nmol), scrambled shRNS-t (17,5 nmol és 1,75 μmol; 1 ekv. illetve 100 ekv. az I-plazmid mennyiségéhez) (SN-1003; Bioneer, Seoul, Korea), scrambled plazmid keveréket (17.5 nmol; scrambled shRNA expressziós plazmidkeverék; Cosmo Genetech), scrambled plazmid gél (X-DNS-szel enzimatikusan térhálósított scrambled plazmidkeverék), az I-gél komponens (csak X-DNS, csak I-plazmid, vagy ezek keveréke enzimatikus térhálósítás nélkül; azaz gélképződés nélkül), vagy Blank-gél (csak X-DNS enzimatikus térhálósítása) közvetlenül a GFP-expressziós reakcióoldathoz adtuk. Minden reakciót legalább háromszor végeztünk el. Eltérő rendelkezés hiányában a reakció térfogatát 25 μl-en tartottuk. A fluoreszcencia spektrumokat spektrofluorofotométerrel (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seoul, Korea) segítségével határoztuk meg a GFP-expresszió szintjét a sejtlizátum oldatban.

Teljes RNS-előkészítés és reverz transzkripció

Spike-in kontrollként 3 µl cel-miR-39-et (33 fmol/µL; No. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Kanada) adtunk az összes előexprimált sejtlizátumhoz (20 µl) az RNS extrakció előtt. Ezután a teljes RNS-t 23 µL lizátumból TRIzol Reagenssel (Ambion, Thermo Fisher Scientific) extraháltuk a gyártó utasításai szerint. A kivont teljes RNS-t 10 µL DEPC-vel kezelt vízben (Ambion, Thermo Fisher Scientific) oldottuk fel. Ezután 2 µL teljes RNS-t 1 mM ATP-vel poliadeniláltunk 1 × poli(A) polimeráz pufferben, amely 5 U Escherichia coli poli(A) polimerázt (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) tartalmazott, 37 °C-on 30 percig 20 µL reakcióelegyben. A reverz transzkripcióhoz 4 µL farok RNS-t 1 pmol RT primerrel és 0,5 mM dNTP keverékkel kevertünk, majd DEPC-vel kezelt vízzel 13 µL térfogatra egészítettük ki. Az elegyet 5 percig 65 °C-on melegítettük, majd jégen gyorsan lehűtöttük. A reakcióelegyet ezután 5 mM ditiotreitol, 1 × első szál puffer, 40 U RNáz-inhibitor és 200 U SuperScript III reverz transzkriptáz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) hozzáadásával 20 µL végtérfogatra állítottuk be, majd 50 °C-on inkubáltuk 1 órán át, majd az enzimet 15 percig 70 °C-on inaktiváltuk. Az RT-primer szekvenciákat (lásd az 5. kiegészítő táblázatot) az RNS-szekvenciából történő cDNS szintézishez terveztük. A felhasznált primer a 3′ RACE adapter volt, amelyet a FirstChoice RLM-RACE kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific) tartalmaz. Minden primert a Cosmo Genetech szintetizált, kivéve a cel-miR-39 forward primert (Norgen Biotek Corp.). Az egyes lizátumoldatokban lévő RNS visszanyerési arányát a kapott spike-in kontroll és a referencia cel-miR-39 CT értéke közötti különbségből becsültük (nem folytattuk az extrakciós folyamatot).

Real-time PCR és adatelemzés

A shRNS és a GFP mRNS mennyiségét qPCR segítségével számszerűsítettük a StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével. Az egyes minták qPCR-jét 20 µl össztérfogatban végeztük 2 µl cDNS, 10 µl 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) és 10 pmol minden egyes primerrel. Az amplifikációt a következő körülmények között végeztük: kezdeti denaturálás 95 °C-on 10 percig; majd 30 ciklus 95 °C-on 15 másodpercig, 60 °C-on 30 másodpercig és 72 °C-on 30 másodpercig. A qPCR-t cel-miR-39 referenciarNS-szel is elvégeztük, hogy megkapjuk a teljes RNS visszanyerési arányát az egyes mintákban. A qPCR protokoll megegyezett az ebben a szakaszban leírtakkal, kivéve a használt primereket, amelyek 10 pmol közös reverz primer (ugyanaz, mint a shRNS reverz primer) és a cel-miR-39 forward primer voltak. Az egyes amplifikált DNS-termékek olvadási görbéjét úgy kaptuk meg, hogy a qPCR befejezése után mintánként hat alkalommal mértük a SYBR Green festék fluoreszcencia-intenzitás változását, miközben a hőmérsékletet 60 °C-ról 95 °C-ra növeltük + 0,3 °C/s sebességgel. A qPCR-hez használt specifikus primereket a Primer3 program (http://primer3.ut.ee/) segítségével terveztük (5. kiegészítő táblázat). A célpontok relatív expresszióját az összehasonlító 2-ΔΔCT módszerrel határoztuk meg. A GFP mRNS relatív mennyiségét 2%-os agaróz gélen végzett sávintenzitásméréssel is megerősítettük. A cDNS amplifikációját ugyanazokkal a PCR körülményekkel és programmal végeztük, mint a fent leírt qPCR során, kivéve a PCR ciklusszámot (20 a GFP mRNS esetében).

Az abszolút RNS mennyiség kalibrálása és számszerűsítése

Az RNS koncentráció és a CT érték standard görbéit az egyes RNS standard anyagok felhasználásával kaptuk. A shRNS esetében a standard görbét az Integrated DNA Technologies-tól vásárolt szintetizált shRNS-ek felhasználásával kaptuk. A GFP mRNS esetében a görbét a gyártó utasításainak megfelelően egy transzkripciós készletből (Riboprobe; Promega) kivont GFP mRNS felhasználásával kaptuk. A standard shRNS RNS mennyiségét az Integrated DNA Technologies tájékoztatta, míg a kivont standard GFP mRNS RNS mennyiségét az UV/Vis abszorpciós értékéből határoztuk meg a BioSpectrometer segítségével. A kapott standard RNS-eket reverz transzkripcióval cDNS-vé alakítottuk át, a “Teljes RNS-előkészítés és reverz transzkripció” szakaszban leírtak szerint. Ezt követően a cDNS-t 10, 100, 1000 és 10 000-szeresére hígítottuk, majd a qPCR-t háromszor megismételtük, és a kapott CT-értékekből standard görbét kaptunk. Az RT-qPCR során kapott CT-értékeket egy kalibrációs folyamat segítségével átszámítottuk a sejtlizátumokban lévő kiindulási RNS-koncentrációkra (6. kiegészítő ábra). Az RNS végső abszolút mennyiségét az egyes RNS-helyreállítási arányok (%) és a kalibrációs görbéből származó RNS-mennyiség értékének megszorzásával határoztuk meg (1., 2. kiegészítő táblázat).

Celluláris jelölés Cy5-I-géllel

Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sejteket a Korea Cell Line Bankból (Szöul, Korea) nyertünk, és 10% magzati szarvasmarha-szérummal és 1% penicillin-streptomicinnel kiegészített DMEM-ben tartottuk nedvesített és CO2 (5%) fenntartású inkubátorban. A GFP-t expresszáló MDCK sejteket (MDCK-GFP) a pEGFP-N1 vektor sejtekbe történő transzfektálásával állítottuk elő Lipofectamine reagensek (Thermo Fisher Scientific) segítségével a gyártó protokolljának megfelelően. Ezt követően a GFP-t kibocsátó sejteket FACSCanto II rendszer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) segítségével szortíroztuk. A sejteket a kutatás során végig negatívan vizsgáltuk mikoplazma-szennyezettségre. A 24 lyukú fedőlapos lemezekben tenyésztett MDCK-GFP sejteket (lyukanként 50 000 sejt) Cy5-I-géllel (Cy5-konjugált I-gél), amely Cy5-konjugált X01 DNS-szekvencia szálakat (2,625 μM X-DNS-nek megfelelő; Integrated DNA Technologies) tartalmazott, szérummentes táptalajban 4 órán keresztül együtt inkubáltuk. A Cy5-I-plazmid előállításához először Cy5-dsDNS-t (Cy5-konjugált dsDNS) állítottunk elő Cy5-konjugált X01 (kiegészítő 5′-p-GATC ragadós véggel) és annak komplementer ellenszála (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′) elegyítésével. Ezután a Cy5-dsDNS-t és az I-plazmidot 5000:1 moláris arányban összekevertük és ligáltuk. A felesleges, nem kötött Cy5-dsDNS-t 4-5-szörös centrifugálással (12 400 g, 4 °C, 60 perc) távolítottuk el Amicon mikrotubuláris centrifugális szűrők (50 kDa Mw cutoff) segítségével. A Cy5-shRNS-t (Cy5-konjugált shRNS) kereskedelmi forgalomban szintetizáltuk (Integrated DNA Technologies). A Cy5-I-plazmid és Cy5-shRNS készletekhez a sejteket 4 órán keresztül koinkubáltuk 2,625 nM-nyi mintával szérummentes közegben. A Lipofectamin-Cy5-I-plazmid és Lipofectamin-Cy5-shRNS készletekhez a Lipofectamint és a Cy5-konjugált mintát elektrosztatikusan komplexáltuk úgy, hogy 1:1 mólarányban összekevertük őket 2,625 μM Lipofectamin és 2,625 μM szubsztrát végkoncentrációjú oldatig. Ezután a sejteket a 2,625 μM Lipofectamin-Cy5-I-plasmiddal vagy a Lipofectamin-Cy5-shRNS-sel együtt inkubáltuk szérummentes közegben 4 órán keresztül. A csak sejteket tartalmazó kontroll esetében a sejteket 1% (v/v) penicillint tartalmazó szérummentes DMEM-mel (HyClone) koinkubáltuk. A 4 órás koinkubációt követően minden mintát kétszer mostunk foszfát-pufferelt sóoldattal (PBS) pufferrel (0,1 M, pH 7,4), majd a sejteket további 6 órán át inkubáltuk 10% (v/v) magzati szarvasmarha-szérumot (FBS; HyClone) és 1% penicillint tartalmazó növekedési táptalajban, hogy biztosítsuk a sejtek megfelelő regenerálódását és a felvételi időt. A tenyésztett sejteket 4%-os formaldehiddel fixáltuk 10 percig szobahőmérsékleten, majd háromszor mostuk PBS pufferrel (0,1 M, pH 7,4). A mikroszkópos képalkotáshoz a rögzített sejteket tartalmazó fedőlemezeket üveglemezekre szereltük fel vizes, fakulásgátlót tartalmazó szerelőközeggel. A fluoreszcencia felvételeket Zeiss Axioplan 2 mikroszkóppal rögzítettük, a képeket pedig Zeiss Axiocam HR kamerával készítettük.

GFP géncsendesítő kísérlet I-gél használatával

Először a 262,5 µM X-DNS-t és 175 nM I-plasmidot tartalmazó I-gélt 300 U T7 RNS-polimerázzal (Thermo Fisher Scientific) inkubáltuk 15 percig szobahőmérsékleten. Az inkubációt követően az I-gél mintát 1% penicillint tartalmazó szérummentes DMEM-ben 100-szorosára hígítottuk. Ezután az I-gél/polimeráz komplex 1/6-os térfogatát adtuk egy 24 lyukú, fedőlemezzel ellátott lemez minden egyes lyukába, amelyet 24 órán keresztül MDCK-GFP sejtekkel (20 000 sejt lyukanként) előneveltünk. Az I-plazmid, a ritkított plazmid keverék és a ritkított plazmid gélkészletek esetében az MDCK-GFP sejteket az egyes plazmidok és a T7 RNS-polimeráz azonos moláris mennyiségével együtt tenyésztettük, mint az I-gél esetében. A csupasz shRNS és a Lipofectamin-shRNS RNSi hatásának méréséhez minden egyes RNS-mintából az I-plazmid templát mennyiségéhez képest 100-szor több RNS-mintát használtunk, figyelembe véve az I-gél sejtlizátum-kísérletből számított shRNS-expressziós arányát. A naked shRNS és a scrambled shRNS készletek esetében az MDCK-GFP sejteket 175 nM RNS-mintával koinkubáltuk. A Lipofectamin-komplexált mintákat a gyártó utasításai szerint készítettük el. A Lipofectamin-I-plazmid és a Lipofectamin-scrambled plazmid keverékkészletekhez a Lipofectamint és az egyes plazmidmintákat elektrosztatikusan komplexáltuk úgy, hogy 5:1 moláris arányban összekevertük őket, hogy 8,75 nM Lipofectamin és 1,75 nM plazmidszubsztrátum végkoncentrációjú oldatot kapjunk. A Lipofectamin-shRNA készlet esetében a Lipofectamint és a szabad shRNS-t elektrosztatikusan komplexáltuk úgy, hogy 5:1 mólarányban összekevertük őket, hogy 875 nM Lipofectamin és 175 nM shRNS végső oldatkoncentrációt kapjunk. Az MDCK-GFP sejteket az így elkészített Lipofectamin-komplexált mintákkal együtt inkubáltuk szérummentes közegben 4 órán keresztül. A csak sejteket tartalmazó készlet esetében csak az MDCK-GFP sejteket inkubáltuk szérummentes közegben 4 órán keresztül, minták nélkül. A 4 órás együttkeltetés után minden mintát kimostunk, és a sejteket emellett 48 órán át inkubáltuk a növekedési tápfolyadékkal (DMEM, amely 10% (v/s) FBS-t és 1% penicillint tartalmazott) az RNS-csendesítő hatás értékeléséhez 37 °C-on, 5% CO2 mellett. Ezután a sejteket 4%-os formaldehiddel 10 percig szobahőmérsékleten fixáltuk, majd PBS pufferrel (0,1 M, pH 7,4) mostuk. A mikroszkópos képalkotáshoz a fedőszalaggal rögzített sejteket üveg tárgylemezekre szereltük fel vizes, fakulásgátlót tartalmazó szerelőközeggel.

Gén-expressziós elemzés kvantitatív PCR segítségével élő sejtekben

Minden mintát ugyanolyan mennyiségben és ugyanolyan körülmények között kezeltünk és inkubáltunk az egyes sejtközegekben, mint a korábban leírt GFP géncsendesítő kísérletben használt I-gél szelvényt használva. Az inkubáció után a sejtközeget kiszívtuk a sejttenyésztő lemezekből, és az MDCK-GFP sejteket egyszer átmostuk PBS pufferrel, majd tripszináltuk a lemez minden egyes mélyedésében lévő sejtek leválasztásához. A levált sejteket PBS-pufferrel hígítottuk a tripszin inaktiválása érdekében, majd 1,5 ml-es mikrocsőbe gyűjtöttük és centrifugálással (180 g, 5 perc) pelletáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és a sejteket 20 µl PBS-pufferrel hígítottuk. A sejtszuszpenziós oldatot (20 µL) 1 mL TRIzol-reagenssel, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL) és 200 µL kloroformoldattal kezeltük. Az ezt követő RNS extrakciót a gyártó utasításai szerint végeztük. A GFP mRNS és a shRNS relatív mennyiségének sejtszintű számszerűsítéséhez a mintapreparátumok összes qPCR-jét a “Teljes RNS előkészítése és reverz transzkripció” és a “Valós idejű PCR és adatelemzés” fejezetekben leírt módszerrel végeztük el.

Cellaképelemzés a pixelintenzitás számszerűsítéséhez

A sejtkép feldolgozását a MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA) programmal végeztük. A nyers fluoreszcenciaképeket importáltuk a MATLAB-ba, és a képek minden egyes pixelét a mátrix minden egyes komponensévé konvertáltuk. Az egyes komponensek fluoreszcencia-intenzitásának eloszlását hisztogrammal grafikusan ábrázoltuk. A teljes adatkészletet 256 intervallumra osztottuk.

Fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás elemzése

A sejteket egyszer mostuk 1 mL PBS-szel, majd a sejttenyésztő lemezekből kiszívtuk a táptalajt. Ezután a sejteket tripszin kezeléssel leválasztottuk a lemezről. A levált sejteket 15 ml-es csőbe gyűjtöttük, majd centrifugálást követően pelletet kaptunk (180 g, 3 perc). A felülúszó tripszinoldatot eltávolítottuk, és a sejtpelletet kétszer mostuk 2 mL PBS-szel. A sejteket PBS-ben újra szuszpendáltuk, hogy 50 000 sejt/ml koncentrációjúak legyenek. Ezután a mintákat úgy készítettük elő, hogy a sejteket 1%-os formaldehid oldatban 10 percig szobahőmérsékleten fixáltuk. A mintákat FACSCanto II rendszerrel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) elemeztük a GFP fluoreszcencia intenzitását.

Relatív életképességi szintek sötét állapotban

Az MDCK-GFP sejtszuszpenziót (5000 sejt/lyuk) 96 lyukú lemezbe (Corning Inc., Corning, NY, USA) adagoltuk és 1 napig 37 °C-on, 5% CO2 mellett inkubáltuk. Miután a sejtek a lemezhez rögzültek, a sejteket az I-gél különböző koncentrációival (az X-DNS koncentrációnak megfelelően) a növekedési tápfolyadékban (DMEM, amely 10% (v/v) FBS-t és 1% penicillint tartalmazott) sötétben együtt inkubáltuk. Az I-gél 1500:1 X-DNS:I-plazmid moláris arányú volt. Ezeket a mintákat 6, 24 és 48 órán át inkubáltuk 37 °C-on, 5% CO2 mellett. Az egyes inkubációs idők végén Cell Counting Kit-8 oldatot (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japán) adtunk a mintákhoz a gyártó utasításainak megfelelően. További 1 órás inkubációt követően a 450 nm-en mért abszorbanciát mikrolemez olvasóval mértük. A mérés eredményét a minta és a minta inkubálása nélküli negatív kontroll sejtek abszorbanciájának arányaként fejeztük ki.

Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzést Prism 7.05 szoftverrel (GraphPad Software) végeztük Student’s t teszt, egyutas ANOVA Bonferroni többszörös összehasonlítás utáni teszttel. A Holm-Bonferroni többszörös összehasonlítás utáni tesztet a Prism 7.05 szoftver (GraphPad Software)30 Bonferroni többszörös összehasonlítás utáni teszt eredményeinek felhasználásával végeztük. A normalitás vizsgálatát a Shapiro-Wilk teszt segítségével számították ki. A Shapiro-Wilk teszt eredményei szerint az adatok megközelítőleg normális eloszlásúak voltak. A statisztikai szignifikanciát *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 jelzi.

.