A 2019-es koronavírusos betegség (COVID-19) olyan fertőző betegség, amely globális világjárványt okozott, mintegy 200 ország vagy terület több mint 36 millió fertőzött emberével, több mint 1 millió halálos áldozattal (Egészségügyi Világszervezet (WHO), 2020). A COVID-19 kórokozója, a súlyos akut légzőszervi szindrómás koronavírus 2 (SARS-CoV-2) feltételezhetően denevérekből származik, mivel a denevérek által terjesztett RaTG13 koronavírus az eddigi legközelebbi genetikai rokon (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Több fajt is vizsgáltak, hogy meghatározzák lehetséges köztes gazdaként betöltött szerepüket (Shi et al., 2020). Ezenkívül a COVID-19-hez hasonló betegséget rekonstruáló állatmodellek fontos kutatási irányvonalnak számítanak, és szükségesek a terápiás gyógyszerek és profilaktikus vegyületek kifejlesztéséhez.
Mellett, hogy több modellezési tanulmány is javaslatot tett a SARS-CoV-2-re fogékony potenciális állatfajokra (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), több kísérleti fertőzés már kimutatta a fogékony állatok széles körét. Konkrétan az egyiptomi gyümölcsdenevér, a vadászgörény, a szíriai aranyhörcsög, a macska, a humanizált angiotenzin-konvertáló enzim 2-t (ACE2) expresszáló egerek, a BALB/c egerek (mutált SARS-CoV-2-t használva több sejttenyésztési passzázs révén) és néhány főemlős faj megengedő a vírusfertőzésre, a szubklinikustól az enyhe és közepes fokú légúti megbetegedésig (Bao et al., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Kísérleti szempontból a kutyák SARS-CoV-2 iránti fogékonysága korlátozott, mivel a beoltott állatok részben szerokonvertálódhatnak (Shi et al., 2020). Ezzel szemben csirke, kacsa és sertés intranazális beoltása nem eredményezett fertőzésre utaló jeleket (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
A sertést gyakran használják a kutatásban, mivel anatómia, genetika, fiziológia és immunológia tekintetében hasonlóságok állnak fenn az emberrel. Sőt, a sertéseken végzett kísérletek valószínűleg jobban előre jelzik az embereken végzett terápiás és megelőző kezelések eredményeit, mint a rágcsálókon végzett kísérletek (Meurens et al., 2012). Mivel azonban a sertések intranazálisan beoltva nem fogékonyak a SARS-CoV-2 fertőzésre (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), meg kell vizsgálni annak lehetőségét, hogy más lehetséges beoltási módok segítségével sertésfertőzési modellt fejlesszünk ki ezzel a vírussal. A sertések tesztelésének fő racionalitása az, hogy e faj ACE2-receptora működőképes, akár sertés ACE2 transzfektálásával HeLa sejtekben (amelyek nem expresszálják konstitutívan a humán ACE2-t) (Zhou és mtsai., 2020), akár azzal, hogy a SARS-CoV-2 S-fehérjével rendelkező pszeudorészecskék képesek sertés vesesejteket fertőzni (Letko és mtsai., 2020). Továbbá az ACE2 fehérje a sertések minden fontosabb szövetében kifejeződik, ahogyan azt immunhisztokémiai módszerrel értékelték (Xiao és mtsai., 2020). Következésképpen egy feltételezett COVID-19 sertésmodell felállítása érdekében megvizsgáltuk a SARS-CoV-2 különböző természetes és nem természetes úton történő beoltásának hatását házisertésekben (Sus scrofa domesticus).
E célból négy, öt darab 5-6 hetes hagyományos malacból (Landrace × Large White) álló csoportot választottunk ki és oltottunk be különböző úton: intranazálisan (IN, 1,5 ml/nosztril; teljes térfogat 3 ml), intratracheálisan (IT, 3 ml) a korábban leírtak szerint (Garcia-Morante et al, 2016), intramuszkulárisan (IM, 1 ml a nyakizmok mindkét oldalára; teljes térfogat 2 ml) vagy intravénásan (IV, 2 ml), a SARS-CoV-2 izolátum (GISAID ID EPI_ISL_510689) szövettenyészetben fertőző dózisának (TCID50) 105,8 végső dózisával állatonként. Az IT és az IV csoportokat az oltás előtt 10 mg/kg ketaminnal és 0,8 mg/kg xilazinnal altatták. A SARS-CoV-2 passage-2 SARS-CoV-2-t Vero E6 sejtekben (ATCC CRL-1586) szaporítottuk és titráltuk, a többi koronavírus esetében alkalmazott protokoll szerint (Rodon et al., 2019). Két további sertést használtunk negatív kontrollként.
Minden állat szeropozitív volt a sertés légúti koronavírussal szemben, ahogyan azt egy kereskedelmi ELISA (INgezim Corona Diferencial 2.0 ) meghatározta. Figyelembe véve, hogy az alfa- és béta-koronavírusok között nem írtak le antitest-keresztreaktivitást (Okba és mtsai., 2020), az állatokat a vizsgálatban tartották. A PRCV-vel szembeni kezdeti reaktivitás várható volt, mivel ez a vírus mindenütt jelen van az európai sertésállományban (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Az állatkísérleteket az Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) intézményi állatjóléti bizottsága és a Katalán Autonóm Kormány Állatkísérleti Etikai Bizottsága hagyta jóvá, és tanúsított személyzet végezte. A SARS-CoV-2-vel végzett kísérleteket az IRTA-CReSA (Barcelona, Spanyolország) biológiailag biztonságos, 3. szintű (BSL-3) létesítményeiben végezték.
A beoltás utáni 2. és 22. napon (dpi) két, illetve három állatot/csoport (IT, IM és IV) elaltattak. Mivel az IN inokulációról már bebizonyosodott, hogy nem hatékony a SARS-CoV-2 fertőzés kiváltásában (Shi et al., 2020), az ezen az úton beoltott sertéseket az 1. és 2. pi napon elaltattuk, hogy felmérjük a szövetekben a lehetséges átmeneti korai fertőzés bizonyítékát. A negatív kontrollállatokat a kísérlet megkezdése előtt elaltatták. A minták gyűjtése és feldolgozása a korábban leírtak szerint történt (Vergara-Alert et al., 2017). Röviden, minden állatnál teljes nekropsziát végeztünk. Számos szövetet (frontális, mediális és caudalis turbinák; proximális, mediális és disztális légcső; nagy és kis bronchus, bal koponya, mediális és caudalis tüdőterület; vese; máj; szív; és lép) vettünk, 10%-os semleges pufferelt formalinba merítéssel fixáltuk, paraffinba ágyaztuk és 3 µm-es metszeteket készítettünk a tárgylemezek elkészítéséhez. A szövettani tárgylemezeket hematoxilinnal és eozinnal (HE) festették meg az esetleges mikroszkópos elváltozások értékeléséhez. Emellett ugyanezeket a szöveteket, valamint az ileumot, nyaki nyirokcsomót (LN), mediastinalis LN-t, mesenterialis LN-t, szaglógumót, mandulát, tímuszt, parotis nyálmirigyet, mellékvesét, hasnyálmirigyet, agytörzset, szemhéjat és csontvelőt Dulbecco módosított Eagle médiumban (DMEM), gyöngyökkel ellátott csövekben vettük a SARS-CoV-2 upE gén RT-qPCR segítségével történő kimutatásához (Corman et al., 2020). Orr- és végbéltamponokat is vettünk (az első héten naponta, valamint 14 és 22 dpi-nél), hogy a fent említett RT-qPCR segítségével elemezzük őket a vírus-RNS jelenlétére. A 0., 14. és 22. pi napon gyűjtött szérummintákat házon belüli ELISA-val (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020) vizsgáltuk a SARS-CoV-2 tüske S1 + S2 és nukleokapszid (N) fehérjék elleni antitestek jelenlétére. Emellett vírusneutralizációs vizsgálatot is végeztünk egy korábbi protokoll szerint, kisebb módosítással (Rodon et al., 2020), a szérumok és a SARS-CoV-2 sorozatos hígításait 1 órán át inkubáltuk 37°C-on a lemezes vizsgálat elvégzése előtt.
Minden állatot naponta megfigyeltünk, de egyikük sem mutatott klinikai tüneteket a SARS-CoV-2 beoltást követően. A SARS-CoV-2 fertőzésre visszavezethető durva vagy mikroszkópos elváltozásokat sem találtak a vizsgált állatok egyikénél sem az összes oltási csoportból, sem a kontrollcsoportból (az adatok nem láthatóak).
A sertések egyikénél sem volt vírusos RNS orr- vagy végbélnyálkahártyán történő kiválasztása. Egy IN-beoltott állat proximális légcsöve 1 dpi-nél pozitív volt vírus-RNS-re (Cq = 24,36). Az ettől az állattól és a többi sertéstől származó többi szövet RT-qPCR negatív lett (qPCR kimutatási határ 38,6 ciklus).
14 és 22 dpi-re a Spike fehérje ellen irányuló antitestek alacsony szintje volt kimutatható az IM és az IV csoportból származó összes állatban (1a. ábra). Továbbá ezek a sertések 22 dpi-nél semlegesítő antitesttitereket is mutattak (74 és 317 SNT50 reciprok hígítási titer között) (1b. ábra). Az N-fehérje ellen irányuló alacsony ellenanyagszintet is találtak a kísérlet végére háromból egy IM és az összes IV-ben beoltott állatnál (az adatok nem láthatóak). Fontos, hogy az IT csoportból egyetlen állatnál nem mutatkoztak S elleni antitestek, de az N fehérje elleni antitestek, valamint neutralizáló titerek (SNT50 reciprok hígítási titer 29) a 0. pi napon, ami egy másik sertést fertőző koronavírussal való lehetséges keresztreakcióra utalhat. Megjegyzendő, hogy ezek az N-fehérje elleni antitestek a kísérlet végére csökkentek, ami arra utal, hogy anyai eredetűek voltak. Ezenkívül ez az állat nem mutatott szeroneutralizáló antitesteket a 22 dpi-n (1b. ábra).
A jelen adatok azt mutatják, hogy a SARS-CoV-2 nem volt képes megfertőzni a sertéseket a vizsgált útvonalak egyikén, nevezetesen IN, IT, IM és IV útján. Ezért erőfeszítéseink megerősítik azokat a korábbi kísérleteket, amelyek a sertés általi fertőzés fogékonyságának hiányát jelezték (Schlottau és mtsai., 2020; Shi és mtsai., 2020), bár felhasználható a készülő vakcinajelöltek immunogenitásának értékelésére.
Fontos, hogy a jelenlegi vizsgálat túlmutat a SARS-CoV-2-vel és sertésekkel végzett más vizsgálatokon, mivel az oltási útvonalak szélesebb körét vizsgáltuk. Ezek közül azonban egyik sem eredményezett produktív fertőzést malacokban. E vizsgálat jelentős eredménye volt a Spike-glikoprotein elleni szerokonverzió bizonyítása a 14. és 22. pi napon, valamint a neutralizáló antitestek jelenléte a 22. pi napon a parenterális úton (IM és IV) beoltott sertésekben. Figyelembe véve a kísérlet rövid időtartamát (22 nap), az ilyen szerokonverzió hangsúlyozza a sertés potenciális érdekességét a SARS-CoV-2 immunogenitási vizsgálataiban való felhasználásra. Valójában a sertés mint az immunológia, valamint a humán gyógyászatban alkalmazható fiziológia, farmakológia és sebészet megfelelő állatmodelljének érdekessége széles körben elismert (Rothkötter, 2009).
Végeredményben a jelen vizsgálat megerősíti, hogy a malacok nem megfelelő állatmodell a COVID-19 számára, de potenciális hasznossága a preklinikai vakcinafejlesztési vizsgálatokban az immunogenitás modelljeként további vizsgálatot érdemel.
Megállapítható, hogy a malacok nem megfelelő állatmodell a COVID-19 számára.