ABT-263: Egy potenciális és szájon át biológiailag elérhető Bcl-2 család gátló

Eredmények

Az ABT-263 egy szájon át biológiailag elérhető Bcl-2 család gátló. Az ABT-737 nemkívánatos gyógyszer-tulajdonságokat kölcsönző szerkezeti jellemzői a nagy felületű gátláshoz nélkülözhetetlen tervezési elemekből, a hidrofób fehérje-fehérje kölcsönhatásból és a szérumalbumin kötődés csökkentéséből adódnak (4-6). E viszonylag nagy (MW >800) molekula orális hatékonyságának javításához gondos egyensúlyra volt szükség a célpont-affinitás, a sejthatás és az orális felszívódás között. Az ABT-737 gerincén három kulcsfontosságú helyet azonosítottak, amelyek befolyásolják a töltésegyensúlyt, a metabolizmust és az orális felszívódást (1. ábra). Az ezeken a pozíciókban módosításokat tartalmazó analógokat optimalizáltuk, hogy maximalizáljuk a farmakokinetikai/farmakodinamikai kapcsolatot az állatokban történő orális expozíció és a humán tumorsejtvonalakban elért hatékonyság között. Ezen erőfeszítések eredményeként azonosították az ABT-263.

Az ABT-263 nagy affinitást tart fenn a Bcl-xL, Bcl-2 és Bcl-w iránt, ami a fluoreszcencia-polarizációs teszt kimutatási határa alatt van (Ki ≤1 nmol/L), de gyengébben kötődik az Mcl-1-hez és az A1-hez (1. táblázat). Ez a szelektivitási mintázat hasonló az elődjéhez, az ABT-737-hez és a csak BH3-at tartalmazó Bad fehérjéhez (12). Az ABT-263 szubnanomoláris affinitását a Bcl-xL-hez egy érzékenyebb időfelbontású fluoreszcencia-rezonancia-energiaátviteli próbával igazolták, amely szerint az enantiomer (a kevésbé aktív kontrollként használt, a morfolin-etilcsoport ellentétes konfigurációjú sztereoizomerje) ∼40-szer kevésbé hatékony.

Az ABT-263 farmakokinetikai profilját alacsony plazma-clearance értékek és alacsony megoszlási térfogatok jellemzik egérben, patkányban, kutyában és majomban, az i.v. adagolást követően 4,6 és 8,4 óra közötti plazmaeliminációs felezési idővel (S1 kiegészítő táblázat). A szájon át történő beadást követő biológiai hasznosulás ∼20% volt mind a négy fajban. Alacsony vizes oldékonysága miatt az ABT-263 elhúzódó oldódási sebességgel korlátozott orális felszívódást mutat. A lipid alapú készítményekben, amelyekben a vegyület lényegesen jobban oldódik, p.o. adagolása fokozott felszívódást eredményez, a biológiai hasznosulás közel 50%-os, a kutyáknál 8,9 órás orális eliminációs felezési idővel. Az i.v. vagy p.o. adagolást követő reprezentatív plazma hatóanyag-koncentrációs görbe kutyában az S1. kiegészítő ábrán látható.

AzABT-263 mechanizmuson alapuló citotoxicitást mutat. Számos BH3 mimetikus kismolekuláról számoltak be arról, hogy szerény affinitással kötődnek a Bcl-2 család tagjaihoz és apoptózist indukálnak tumorsejtvonalakban (21-23). A közelmúltban azonban számos ilyen szerről kimutatták, hogy Bax/Bak-független módon pusztítja a sejteket, ami megkérdőjelezi a Bcl-2 fehérjékhez való gyenge affinitásuk funkcionális jelentőségét és e molekulák valódi hatásmechanizmusát (14). Ezért fontosnak tartottuk, hogy határozottan bizonyítsuk, hogy az ABT-263 által kiváltott apoptózis a Bcl-2 család fehérjéinek gátlásának közvetlen eredménye. Először az ABT-263 sejtaktivitását vizsgáltuk az interleukin-3 (IL-3) függő prolimfocita FL5.12 egér sejtvonalon. Az IL-3 megvonása az FL5.12 apoptózist indukál, részben a Bim és a Puma proapoptotikus faktorok felszabályozása révén (24, 25). A Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) vagy a Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) overexpressziója a Bim és a Puma szekvenálása révén véd az IL-3 megvonásának hatásaival szemben (25). Az ABT-263, de nem az enantiomer, megfordította a Bcl-2 vagy a Bcl-xL túlterjedése által nyújtott védelmet (EC50 = 60 és 20 nmol/L, illetve; 2A ábra). Az ABT-263 hatástalan volt a sejthalál kiváltásában IL-3 jelenlétében, ahol az FL5.12 sejtek nem voltak kitéve proapoptotikus ingereknek. Az ABT-263 FL5.12-Bcl-2 vagy FL5.12-Bcl-xL sejtek elpusztítására való képessége IL-3 megvonása mellett jelentősen csökkent a ZVAD kaszpáz inhibitor jelenlétében, ami arra utal, hogy a sejtpusztulás kaszpázfüggő (S2. kiegészítő ábra).

Az ABT-263 által kiváltott citotoxicitás vajon az intracelluláris Bcl-2 család fehérje-fehérje kölcsönhatások megszakításának tulajdonítható-e, koimmunoprecipitációs vizsgálatokat végeztünk. Az ABT-263 dózisfüggő csökkenést idézett elő a Bim:Bcl-xL kölcsönhatásokban a kezelést követő 2 órán belül az FL5.12-Bcl-xL sejtekben (S3. kiegészítő ábra). Hasonló mintázatot figyeltünk meg a Bim:Bcl-2 komplexek megszakításánál is FL5.12-Bcl-2 sejtekben (az adatok nem láthatóak), ami azt jelzi, hogy az ABT-263 az IL-3-függő sejthalált azáltal állítja helyre, hogy gyengíti a Bcl-xL és a Bcl-2 azon képességét, hogy szekvenálja az olyan proapoptotikus faktorokat, mint a Bim. Az ABT-263-nak a Bcl-2 család fehérje-fehérje kölcsönhatásait megzavaró képességét emlős kéthibrid rendszerben is megerősítették (2B. ábra). Az ABT-263 gátolta a VP16-Bcl-xS és a Gal4-Bcl-xL kölcsönhatását (látszólagos EC50 ∼50 nmol/L), míg az enantiomer sokkal kevésbé volt hatékony.

A hatásmechanizmus további vizsgálatához az ABT-263 aktivitását egér embrionális fibroblaszt (MEF) sejtek sorozatán vizsgáltuk, amelyek között vad típusú (WT), valamint Bcl-x, Mcl-1 és Bax/Bak hiányos (DKO) sejtek is voltak. Az ABT-263 az Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/L), de a Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/L) MEF-sejtekben nem indukált sejtpusztulást (S4A kiegészítő ábra). Ez megerősíti az ABT-263 képességét a Bcl-xL, de nem az Mcl-1 funkcionális gátlására sejtes kontextusban, és összhangban van az ABT-737-mal végzett korábbi megfigyelésekkel (7, 11, 13, 14, 26). Az enantiomer mindkét rendszerben hatástalan volt. Az ABT-263 szintén hatástalan volt (EC50 ≥10 μmol/L) a WT vagy DKO MEF sejtek elpusztításában, ami összhangban van a korábbi jelentésekkel (14). Ezzel szemben az etopozid, egy általános citotoxikus szer, valamint két bejelentett kismolekulás BH3-mimetikum , mind a négy MEF-sejttípusban hasonló EC50-ekkel indukált sejthalált, ami arra utal, hogy ezek a vegyületek legalább részben a Bcl-2 családtól független mechanizmusok révén indukálják a sejthalált (Kiegészítő ábra. S4C).

Az ABT-263-nak egy humán tumorsejtvonalban az apoptózist közvetlenül előidéző képességének értékeléséhez a Bax-transzlokációt és a citokróm c felszabadulását követtük nyomon a H146-os SCLC-sejtvonalban. A H146-ról kimutatták, hogy túlélése a Bcl-2-től függ (25). Az ABT-263 a kezelést követő 2 órán belül a citoszolikus Bax dózisfüggő csökkenését idézte elő a citoszolikus citokróm c növekedésével párosulva (2C-i ábra). Az enantiomer nem tudott hasonló választ kiváltani. A Bax aktiválódását és a citokróm c felszabadulását mikroszkópiával igazoltuk (2C-ii. ábra). A 6A7 anti-Bax antitestet, amely specifikusan felismeri a Bax konformációsan aktív formáját, használtuk az aktivált Bax kimutatására a H146 sejtekben. A frakcionálási vizsgálatokkal összhangban az ABT-263 kezelés az aktivált Bax jelentős növekedésével járt. Ez megfelelt a citokróm c felszabadulásának a mitokondriumból a citoszolba, amit a pontszerű struktúrák csökkenése és a citoszolikus festődés növekedése bizonyít. Az ABT-263, de nem az enantiomerje, a kaszpáz-3 aktivitás időfüggő növekedését is kiváltotta, amely 2 órakor volt kimutatható, és amely ∼6 órakor érte el a csúcspontját (2D ábra). Ez a hatás koncentrációfüggő volt, az EC50 ∼100 nmol/L a 6 órás időpontban (2D ábra, betét). Ezzel szemben a kamptotecin, egy topoizomeráz I gátló, amelyről azt jelentették, hogy mitokondriális apoptózist és azt követő kaszpáz aktivációt indukál (27, 28), csak 24 óra elteltével volt képes kiváltani a kaszpáz-3 aktivitás növekedését (az adatok nem láthatóak). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az ABT-263 közvetlenül a Bcl-2 és a Bcl-xL gátlására hat, felszabadítva az olyan proapoptotikus faktorokat, mint a Bim, hogy a mitokondriális apoptotikus útvonal gyors aktiválódását idézze elő.

Az ABT-263 sejtaktivitásának szélességének értékeléséhez humán tumorsejtvonalak egy, a különböző tumortípusokat felölelő panelét vizsgálták. Az ABT-737-ről szóló korábbi jelentésekkel (12) összhangban az ABT-263 egy hatóanyagú aktivitást mutatott SCLC-ben és hematológiai malignitásokban, de a többi tumortípus többségében nem (az adatok nem láthatóak). Az ezen érzékeny tumortípusokon belüli aktivitás alaposabb vizsgálata érdekében az ABT-263-at SCLC-ből (n = 22) és hematológiai malignitásokból (n = 23) származó sejtvonalak paneljein vizsgálták. Az ABT-263 mindegyik panelben különböző hatékonyságot mutatott, a sejtvonalak 32%-a (SCLC) és 48%-a (hematológiai) volt nagyon érzékeny (EC50 <1 μmol/l; 3. ábra). Az enantiomer >20-szor kevésbé volt aktív ezekben az érzékeny sejtekben (S2. kiegészítő táblázat).

Az ABT-263 orális adagolása az SCLC és ALL xenograft tumorok in vivo regresszióját eredményezi. E megfigyelések in vivo kiterjesztése érdekében az ABT-263-at néhány érzékeny SCLC és hematológiai sejtvonalból létrehozott szárnyas xenograft modellben vizsgálták. Az ABT-263 p.o., naponta egyszer, 100 mg/kg adagban, 21 egymást követő napon keresztül adagolva gyors és teljes tumorválaszt (CR) váltott ki, amely a kezelés befejezése után több hétig tartós volt minden H889 (SCLC) vagy RS4;11 (ALL) tumort hordozó állatban (4A. ábra). A H146 SCLC tumort hordozó egerek hasonló kezelése gyors regressziót idézett elő, ami az állatok 60%-ában CR-t, 40%-ában pedig PR-t eredményezett (4A. ábra). Ebben a modellben az adagolás befejezése után néhány héttel kezdődő fokozatos tumor-visszaesés volt megfigyelhető. A H146 xenograft modellben a hatás dózisfüggő volt. Az ABT-263 50 mg/kg-os kezelése 21 egymást követő napon keresztül az állatok 22%-ában CR-t, 44%-ában pedig PR-t idézett elő, míg a 25 mg/kg-os kezelés statisztikailag szignifikáns, de szerény tumornövekedés-gátlást idézett elő, megfigyelt tumorregresszió nélkül. Az ABT-263 minden dózisban jól tolerálható volt (<5% súlycsökkenés).

Az ABT-263 expozíció és a tumorellenes hatékonyság összefüggésbe hozására egy állandósult állapotú farmakokinetikai vizsgálatot végeztek, amelyben a nem daganatos egereket 3 napon keresztül naponta egyszer p.o. adagolták, és a harmadik adag után meghatározták a plazma hatóanyag-koncentrációt. Mind a plazma csúcskoncentráció (Cmax), mind a plazmakoncentráció-görbe alatti terület (AUC) arányos volt az adaggal, és nagyjából lineárisan növekedett (S3 kiegészítő táblázat). A 100 mg/kg dózis, amely 100%-os teljes válaszadási arányt eredményezett (teljes válaszadási arány = CR + PR), 7,7 μmol/l és 90 μmol/l h Cmax és AUC értékeket adott. Az 50 mg/kg adagból származó expozíció, amely 66%-os általános válaszadási arányt váltott ki, 5,4 μmol/L (Cmax) és 54 μmol/L h (AUC) volt. Ezek az adatok azt jelzik, hogy az ABT-263 ∼5,4 és 7,7 μmol/L közötti plazma gyógyszer csúcskoncentrációi igen hatékonyak.

Az ABT-263 in vivo fokozza a kemoterápiás szerek aktivitását. Az ABT-263 in vivo hatékonyságát általánosan használt terápiás szerekkel kombinálva vizsgálták a hematológiai malignitások több agresszív modelljében. Az ABT-263-at és a rituximabot a DoHH2 B-sejtes limfóma flank xenograft modellben vizsgálták (4B. ábra). Napi 100 mg/kg p.o. adagolásban, 17 napon keresztül, az ABT-263 44%-os tumornövekedés-gátlást mutatott. A rituximab egyszeri 10 mg/kg-os dózisa 84%-os tumornövekedés-gátlást váltott ki. Sem az ABT-263, sem a rituximab önmagában nem ért el tartós tumorregressziót; a kombináció azonban jobb hatást mutatott, 70%-os CR és 10%-os PR elérésével. Ez a kombináció a tumornövekedés késleltetésének jelentős javulását is eredményezte (>700%) az önmagában alkalmazott rituximabhoz képest (300%).

Az ABT-263 hatékonyságát önmagában és módosított R-CHOP sémával kombinálva is értékelték a köpenysejtes limfóma GRANTA-519 szárnyas xenograft modelljében (4B ábra). Az ABT-263 100 mg/kg p.o. adagban, 21 egymást követő napon keresztül adagolva 40%-os tumornövekedés-gátlást váltott ki. Ehhez képest az R-CHOP-kezelés 68%-kal gátolta a tumor növekedését, 20%-os CR mellett. A kombináció minden vizsgált állatnál drámai tumorregressziót és teljes tumorválaszt eredményezett, kilenc értékelhető tumorból négynél nem volt nyoma a tumor újranövekedésének.

Végezetül megvizsgáltuk, hogy az ABT-263 képes-e potenciálni a kemoterápia hatását egy ABT-263-ra rezisztens modellben. A myeloma multiplex OPM-2 szárnyas xenograft modelljében (in vitro EC50 = 6,7 μmol/l) a 21 napon át naponta 100 mg/kg adagban adott ABT-263 nem gátolta szignifikánsan a tumor növekedését (4B. ábra). A maximálisan tolerálható dózisban (1 mg/kg i.v., qd × 3) adott bortezomib 70%-kal gátolta a tumor növekedését, CR nélkül. Az ABT-263 fokozta a bortezomib hatékonyságát a kombinációval, ami 95%-os tumornövekedés-gátlást és 40%-os CR arányt eredményezett.

Az ABT-263 gyors, de reverzibilis trombocitopéniát indukál. Nemrégiben számoltunk be arról, hogy az ABT-737 gyors és reverzibilis trombocitopéniát indukál állatokban, ami a Bcl-2 család fehérjéinek gátlásából és a keringő vérlemezkék apoptózisának indukciójából ered, csontvelő-toxicitás nélkül (29). A várakozásoknak megfelelően az ABT-263 is trombocitopéniát indukál. Kutyáknál egyszeri p.o. adagot követően a keringő vérlemezkék száma 2 órán belül csökkent, 6 órán belül trombocita mélypontot ért el, és 24 órán belül a trombocita visszaesés jelei mutatkoztak (5A. ábra). A hosszan tartó adagolás hatásainak meghatározása érdekében megvizsgáltuk a farmakokinetikai/farmakodinamikai összefüggést a napi többszöri adagolást követően kutyában (5B. ábra). Az ABT-263-at p.o. 2 mg/kg/nap adagban adtuk 6 napig, majd további 6 napig 6 mg/kg/napra emeltük. A vérlemezkeszámot és a plazma gyógyszerkoncentrációit 6 órával a kezelés után értékeltük, hogy az 1-4. és a 7-11. napon a valószínű vérlemezkeszegek mélypontját rögzítsük. A 2 mg/kg-os adagolásnál a vérlemezkeszám a kezdeti ∼250 000/μL értékről a második adagra ∼125 000/μL értékre csökkent, majd a fennmaradó adagoknál stabilan maradt. A kezelés után 6 órával (C6h) mért plazma hatóanyag-koncentráció 3,6 és 4,2 μmol/l közötti értékek között állandó maradt. Az ABT-263 farmakokinetikai profilja alapján (S1. kiegészítő ábra) a C6h nagyjából 2-szer alacsonyabb, mint a Cmax, ami azt jelzi, hogy a többszörös 2 mg/kg-os adagok után elért plazma hatóanyag-koncentráció csúcsértéke ∼7-8 μmol/L között van. Ezek a szintek hasonlóak az egerekben 100 mg/kg p.o. adag után kapott szintekhez. Amikor az ABT-263 dózisát 6 mg/kg/napra emelték, a vérlemezkeszám ∼50 000/μL-re csökkent e magasabb dózis második napjára, és viszonylag állandó maradt a vizsgálat időtartama alatt. A C6h értékek ezen az adagolási szinten 10,2 és 14,8 μmol/l között mozogtak (Cmax, 20-30 μmol/l). Az ABT-263 jól tolerálható volt ebben a vizsgálatban, halálozás vagy nemkívánatos klinikai tünetek nélkül. A vénapunkció helyén azonban néhány vérömleny jelentkezett, ami a hemosztázis megváltozásának felel meg. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ABT-263 napi ismételt, egérmodellekben igen hatásosnak bizonyult szinteken történő expozíciója a keringő vérlemezkék ∼50%-os csökkenését eredményezi kutyákban. Továbbá a hatásos szintnél többszörösen magasabb plazmakoncentrációk jól tolerálhatók, a keringő vérlemezkék száma ∼50 000/μL-re csökken.