Acetilkolin acetilkoenzim A-ból és kolinból a kolin acetiltranszferáz enzim segítségével szintetizálódik. Az idegrendszerben ez az enzim feltehetően elsősorban az idegvégződések citoplazmájában létezik. A koenzim A a mitokondriumokban szintetizálódik, és a mitokondriális membránon keresztül a citoplazmába történő transzportot követően jut a kolin acetiltranszferázhoz. A májban történő szintézis mellett az acetilkolin-termelésben alkalmazott kolin étrendi forrásokból származik. A kapilláris endotélsejtekben van egy szállítórendszer, amely a kolin szabad és foszfolipid formában történő szállításáért felelős az agyba. A kolint tartalmazó foszfolipidek hidrolízise is felszabadíthatja az acetilkolin szintézisében felhasznált kolint. Mivel a kolin acetiltranszferázt nem telíti az acetilkoenzim-A és a kolin olyan koncentrációja, amely a becslések szerint jelen van az idegvégződésben, úgy tűnik, hogy az acetilkolin szintézis sebessége a prekurzorok elérhetőségétől függ. Az enzimaktivitást a termékgátlás is szabályozza; az acetilkolin a kolin acetiltranszferáz egy alloszterikus helyére kötődve gátolja annak aktivitását. Ezenkívül a tömeghatás és a neuronális aktivitás befolyásolja az acetilkolin-képződés sebességét. Az enzimaktivitás rövid távú szabályozása részben a fehérjekinázok által indukált foszforilációval történik. Az enzimnek nincsenek nagyon specifikus és hatásos gátlói, és meg kell jegyezni, hogy az acetilkolin életciklusának e lépésének farmakológiai blokkolása (pl. naftilvinil-piridinnel) kevésbé mélyreható hatást fejt ki a transzmitterre, mint a kolintranszport gátlása.
A transzmitter citoplazmából a vezikulákba való felvételéért egy specifikus, alacsony affinitású acetilkolin-transzporter felelős. A kolin acetiltranszferáz és a vezikuláris acetilkolin transzporter génjei egyetlen génlókuszban szerveződnek, és a két gén transzkripciója jellemzően együtt szabályozott. A (±)-Vezamicol e transzporter szelektív inhibitora, az L-(-)-Vezamicol hatásosabb, mint a D-(+)-Vezamicol. A vezikulákba csomagolva az acetilkolin exocitózissal ingerek által kiváltott felszabadulásnak van kitéve. Számos erős toxin hat az acetilkolin felszabadulására, különösen a botulinum toxin, amely gátolja a felszabadulást.
A neuronális acetilkolinészteráz nagyon gyorsan inaktiválja az agyban felszabaduló acetilkolin nagy részét, bár a gliasejtekben található butil-kolinészteráz hidrolizálhatja az acetilkolin kis részét a szinapszisban. A periférián az acetilkolinészteráz a kolinerg innervációban részesülő izmokban van jelen, míg a butil-kolinészteráz szélesebb körben elterjedt. Az acetilkolinészteráznak számos reverzibilis (pl. fizosztigmin, BW284C51) és irreverzibilis (pl. izo-OMPA) gátlója ismert, és e gyógyszerek hatására az acetilkolin szinaptikus hatása meghosszabbodik. A második generációs reverzibilis antikolinészterázokat, mint a donepezil, a rivastigmin (ENA 713), az eptastigmin és a galantamin (galantamin) az Alzheimer-kór kezelésére alkalmazzák. Néhány második generációs kolinészterázt már kivontak a klinikai alkalmazásból elfogadhatatlan mellékhatások miatt (pl. takrin, metrifonát). Az irreverzibilis acetilkolinészteráz-gátlókat rovarölő és vegyi harcanyagokként használják. Az acetilkolin-észteráz által az acetilkolinból felszabadított kolint egy nagy affinitású transzporter visszakeríti a kolinerg terminálisokba, és újra felhasználja a transzmitter-szintézisben. A hemikolinium-3 hatásosan és reverzibilisen gátolja a kolin transzportot, és ez az acetilkolin-képződés mélyreható csökkenését eredményezi. A hemikolinium-3-mal ellentétben az A-4 (a HC-3 bisz-4-metil-piperidin analógja) perifériás beadást követően aktív. A kolin nitrogénmustár analógjai a nagy affinitású kolinfelvétel erős irreverzibilis gátlói.