- Abstract
- 1. Bevezetés
- 2. Esettanulmány (klinikai leírás)
- 3. Módszerek
- 3.1. Módszerek . Strukturális modellezés
- 4. Eredmények
- 4.1. Eredmények 4.1. A konformációs variabilitás vizsgálata. Szerkezet-funkció vizsgálatok
- 4.2. Dimerképződési hatások
- 5. Megbeszélés
- 6. Következtetés
- Rövidítések
- Adatok elérhetősége
- Egyetértés
- Érdekütközések
- A szerzők hozzájárulása
- Finanszírozás
- Köszönet
Abstract
Háttér. Az ATP-kötő kazetta, D alcsalád, 1. tag (ABCD1) fehérje egy peroxiszomális fél-transzporter, amely lehetővé teszi a nagyon hosszú láncú zsírsavak (VLCFA) lebontását. Az ABCD1 patogén változatai a VLCFA-k felhalmozódását okozzák a különböző szövetekben és testnedvekben, ami az X-hez kötött adrenoleukodisztrófia (X-ALD) nevű rendellenességet eredményezi. Ezt a rendellenességet leggyakrabban mellékvesekéreg-elégtelenség és magas VLCFA-koncentráció jellemzi, és fenotípustól függően különböző mértékű neurológiai érintettséggel jár. Például az X-ALD csak Addisonra korlátozódó formája nem jár neurológiai hatással, míg az X-ALD agyi formája gyakran súlyos érzékszervi veszteséget, motoros funkciók károsodását, kognitív hanyatlást és halált okoz. Módszerek. Az ABCD1 egy újonnan jellemzett és feltételezett patogén variánsát elemeztük fehérje-informatikai platformunk (PIP) segítségével. A genetikai vizsgálati adatokon személyre szabott fehérjeszintű molekuláris vizsgálatokat végeztünk, kiegészítve az elemzést és a klinikai vizsgálatot. Eredmények. Egy felnőttkori adrenomyeloneuropathia (AMN) esetét és egy új ABCD1 variánst mutatunk be. Az egyedi ABCD1 fehérjét tárgyaljuk, és a próbaidős esetét összehasonlítjuk az AMN-ről szóló meglévő jelentésekkel. Következtetések. A több forrásból származó adatok fúzióját átfogó megközelítésben kombinálták, amely a beteg betegségének és prognózisának gazdagabb értékelését eredményezte. A variánson molekuláris modellezést végeztünk a klinikai jelentőségének jobb jellemzése és a patogenitás megerősítése érdekében.
1. Bevezetés
Az ATP-kötő kazetta, D alcsalád, 1. tag (ABCD1) fehérje az ATP-kötő kazetta transzporter szupercsalád tagja, amely transzmembrán fehérjékből áll, amelyek a lipidek, metabolitok és más molekulák sejtek vagy intracelluláris struktúrák közötti átadásáért felelősek. Az ABCD1 gént az Xq28-on található gén kódolja. Az ABCD1 egy peroxiszomális fél-transzporter, amely ATP megkötésével nagyon hosszú láncú zsírsavakat (VLCFA) importál a peroxiszómába. A diszfunkcionális ABCD1 nem képes a VLCFA-kat a peroxiszómába szállítani, ahol lebomlanak, ami a VLCFA-k felhalmozódását eredményezi a testnedvekben és a szövetekben . A VLCFA-k e rendellenes szintje az X-hez kötött adrenoleukodisztrófia (X-ALD), a leggyakoribb peroxiszóma rendellenesség jellegzetes biomarkere . Az X-ALD egy genetikai állapot, amely elsősorban demyelinizációval, neurodegenerációval és mellékvesekéreg-elégtelenséggel jár . Az ABCD1 génben több mint 800 variánst jelentettek . Ennek ellenére egyértelmű genotípus-fenotípus korrelációt nem figyeltek meg .
A hemizigóta férfiaknál jellemzően a legjelentősebb tünetek jelentkeznek, míg a heterozigóta nőknél gyakran kisebb mértékű fogyatékosság alakul ki az élet későbbi szakaszában . A három klasszikus fenotípus a kizárólag Addison-kór, az adrenomyeloneuropátia (AMN) és az agyi ALD. A csak Addison-kóros formában szenvedő egyéneknél általában 2 és 7 éves kor között jelentkezik mellékvesekéreg-elégtelenség. A neurológiai degeneráció kezdetben nem jelentkezik, de az egyén életkorának előrehaladtával gyakran kialakul. Az AMN jellemzően az élet harmadik-negyedik évtizedében jelentkezik, és elsősorban a gerincvelőt érinti . A klinikai tünet gyakran a lábak progresszív merevsége és gyengesége. A mellékvesekéreg-elégtelenség az AMN-betegek nagyjából 2/3-ánál fordul elő, és az agyi elváltozások körülbelül a betegek felét érintik. Az agyi ALD a legsúlyosabb fenotípus, ahol az agyi demielináció a hallás, a látás, a motoros funkciók és a kogníció gyors hanyatlását okozza . Leggyakrabban gyermekeknél vagy serdülőknél fordul elő, és az X-ALD ezen változata gyakran a tünetek megjelenésétől számított 2-4 éven belül halálhoz vezet.
Ez a beszámoló egy harmincas éveiben AMN-el diagnosztizált próbandus kórtörténetét ismerteti. Az ABCD1 gén molekuláris elemzése egy bizonytalan jelentőségű variánst azonosított ezen az egyénen belül. Érdekes módon ezt a variánst az ALD mutációs adatbázisban patogénnek jelentették, de a klinikai esettel kapcsolatos információkat nem publikálták. Próbaidősünk klinikai esetét azért vettük fel, hogy jobban alátámasszuk ennek az ABCD1 variánsnak a patogenitását. A fehérje-informatikai platformot (PIP) átfogó molekuláris modellezésre használtuk, hogy tovább jellemezzük e variáns jelentőségét és tisztázzuk a probandus diagnózisát.
2. Esettanulmány (klinikai leírás)
A probandus egy 31 éves férfi volt, aki egy progresszív neurológiai állapot kivizsgálására jelentkezett. Az állapot tünetei először 2 évvel ezelőtt jelentek meg, amikor a vizsgálati személy egyre gyakrabban kezdett el botladozni. Később generalizált izomgyengeséget és merevséget tapasztalt, valamint további járászavarokat. Ennek leküzdésére a vizsgálati személy az elmúlt 7 hónapban guruló járókeretet használt a járás segítésére. Vizeletinkontinencia is kialakult nála. Továbbá agyi ködről, memóriazavarról, figyelemzavarról, szorongásról és fáradtságról számolt be. Emiatt az alapvető szellemi feladatok elvégzése hosszabb időt vett igénybe. A vizsgálati személy szerint az alkoholfogyasztás súlyosbította ezeket a hiányosságokat. Végül, a vizsgálati személy 20 kilót fogyott állapota kezdete óta, és az erre irányuló összehangolt erőfeszítések ellenére sem tudott visszahízni. Ez a súlyvesztés részben az émelygés és hányás tüneteinek volt köszönhető, amelyek leginkább reggel jelentkeztek.
A fizikális vizsgálat során a vizsgálati személy képtelen volt felállni ülő helyzetből a keze használata nélkül. Enyhe ataxiás diszartriát állapítottak meg. A vizuális fixációs tesztek ritkán előforduló négyszögletes rángásokat mutattak. A sima törekvések szakkádikusak voltak, és mind függőleges, mind vízszintes irányban lassú, teljes szakkádokat mutatott. A felső végtagokban a nyújtási reflexek kórosan élénkek voltak. A kísérleti személynek kórosan élénk mitotikus nyújtási reflexei voltak az alsó végtagokban is, beleértve a bokák tartós klónuszát. A nagylábujjak propriocepciója mérsékelten károsodott. Az alsó végtagokban enyhe felső motoros neuron-eloszlású gyengeség volt megfigyelhető, az iliopsoas kíméletével. A sarok-lábtőpróba dyssynergiát mutatott. A próbált személy járás közben a lábát nézte, és csökkent léptekkel mozgott. A térdei túlnyújtva voltak, hajlamos volt lábujjhegyen járni, és időnként csúszkált a lábával. A Romberg-jel jelen volt. Állás közben remegő mozgások voltak jelen a lábaiban – túlnyomórészt a négyfejű combizmokban. A kísérleti személy 3 próbán keresztül 360 fokot fordult, ami fordulásonként 9-15 lépést igényelt. A testtartási reflexei kórosak voltak, és a “Pull” teszt -3 volt.
Az agy MRI-je normális volt, a nyaki gerinc MRI-je pedig enyhe, diffúz gerincvelő-atrófiára utaló leleteket mutatott. Nem volt bizonyíték szubakut kombinált degenerációra vagy más szerzett gerincvelőbetegségre (1. ábra). Lyme-kór miatt kezelték, mivel Lyme IgM-titerei pozitívak voltak, de jelentős javulást nem tapasztaltak. Gerincvelői folyadékát acellulárisnak írták le. A HIV, HTLV1, hepatitis C, hepatitis B és citomegalovírus vizsgálata negatív lett. Hasonló tünetekkel járó családi előzményeket nem lehetett megállapítani, mivel a próbált személy kórtörténetének ismerete korlátozott volt (2. ábra).
A vizsgálati személy peroxiszomális zsírsavprofilját a korábbi vizsgálatok és képalkotás után kapták meg. A C26 : 0, C24/C22 és C26/C22 abnormális koncentrációja volt jelen, ami az X-kapcsolt adrenomyeloneuropathia hemizigozitására utalt. Az adrenokortikotrop hormon mértéke 528 pg/ml volt (RR: 7,2-63). Ezt követően elvégezték az ABCD1 gén szekvenálását és deléciós/duplikációs analízisét. A probandus hemizigóta volt az ABCD1 egy bizonytalan jelentőségű, c.1599G>T (p.Lys533Asn) variánsára. Ez a variáns nem volt jelen az ExAC online adatbázisában, bár az ALD Mutation Database-ben patogénként szerepelt. Két hasonló variáns, a c.1596A>G (p.Lys533Glu) és a c.1598A>G (p.Lys533Arg) szintén klinikailag jelentősnek bizonyult korábban .
3. Módszerek
3.1. Módszerek
. Strukturális modellezés
A humán ATP-kötő kazetta D alcsalád 1. tagjának (ABCD1 néven ismert) szekvenciája valószínűleg egy transzporter fehérje, amelynek nukleotidkötő régiója olyan hajtással rendelkezik, amely ATP-kötő alegységként működhet ATPáz aktivitással. Ismert, hogy az aktív transzporter kialakulásához megfelelő dimerizáció szükséges. Az ABCD1 az ALD alcsalád tagja, amely részt vesz a peroxiszomális zsírsavak organellumokba történő importjában. Ezek a peroxiszomális ABC-transzporterek “fél transzporterek”, ami azt jelenti, hogy szükségük van egy partner fél transzporter molekulára – a funkcionális forma mindig homodimer vagy heterodimer. Az ABCD1 feltételezhetően a nagyon hosszú láncú zsírsavak peroxiszomális transzportjának vagy katabolizmusának kulcsa. Az ABCD1-ről ismert, hogy kölcsönhatásba lép a PEX19-cel, és az ABCD1 gént kódolja, amelyet az NCBI referencia hozzáférési szekvenciájából vettünk át: NP_000024: NP_000024.2 verzió, amely az aminosav-szekvenciát kódolja; és számítógépes modellezéshez használták. Monte Carlo szimulációkat végeztünk a mutánson, hogy a teljes hosszúságú 745 aminosav helyi regionális változásait lehetővé tegyük.
A Monte Carlo röntgenfinomítást a YASARA SSP/PSSM módszerrel építettük fel. A szerkezetet a YASARA/Amber erőtérre relaxáltuk a YASARA-n belüli tudásalapú potenciálok segítségével. Az oldalláncokat és a rotamereket tudásalapú potenciálokkal, explicit oldószerrel történő szimulált lágyítással és kis egyensúlyi szimulációkkal állítottuk be a YASARA finomítási protokolljának segítségével. A teljes hosszúságú szerkezetet modelleztük, kitöltve a röntgenfelvételből származó hézagokat vagy fel nem oldott részeket.
A véglegesített modellek finomítását vagy a Schrodinger LC-MOD Monte Carlo-alapú moduljával, vagy a NAMD2 protokollokkal végeztük el. Ezek a finomítások a YASARA által generált kezdeti finomítással és variánssal kezdődtek . Az átfedő régiók szuperpozíciója és későbbi finomítása az ABCD1 teljes modelljét eredményezi. A végleges szerkezeteket energiaoptimalizálásnak vetettük alá PR konjugált gradienssel, R-függő dielektrikummal.
Az atomkonzisztenciát a teljes hosszúságú vad típusú modell (WT) mind a 745 aminosavára (12 201 atom) és a változat 745 aminosavára (12 221 atom) ellenőriztük, ellenőrizve a láncnevek, diéderek, szögek, torziók, nem kötések, elektrosztatika, atomtípusok és paraméterek helyességét. Megjósoltunk egy dimermodellt, amely 24 402 atomból áll, beleértve a kofaktorokat és ionokat is. Minden modellt a következő formátumokba exportáltunk: Maestro (MAE) és YASARA (PDB). A modell manipulálása a Maestro (Macromodel, 9.8-as verzió, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010), vagy a Visual Molecular Dynamics (VMD) segítségével történt. Az elemzések az N-terminális régióra helyezték a hangsúlyt, amely az első 350 aminosavat tartalmazza, tekintettel a mutáció helyétől való hosszra és C-terminális távolságra.
Monte Carlo dinamikai keresést (hibrid MC vagy az MDS-mintavételezés fokozásával) végeztünk minden egyes modellen a konformációs mintavételezéshez, az irodalomban korábban leírt módszerekkel . Röviden, minden ABCD1 variáns rendszert minimalizáltunk lazított korlátozásokkal a Steepest Descent vagy a Conjugate Gradient PR segítségével, majd hagytuk, hogy átessenek az MC keresési kritériumokon, az irodalomban bemutatottak szerint . Az MC elsődleges célja ebben a forgatókönyvben a konformációs variabilitás vizsgálata, amely a különböző mutációkkal a mutációhoz közeli régióban előfordulhat, és a lehetséges hatás a DNS-kötésre vagy az ABCD1 feldolgozására.
4. Eredmények
4.1. Eredmények
4.1. A konformációs variabilitás vizsgálata. Szerkezet-funkció vizsgálatok
A WT és a p.K533E variáns esetében a tárgy stabilitása az aminosavankénti ΔG energetikai számítások alapján viszonylag azonosnak bizonyult, így a WT tárgy stabilitása 114,67 kcal/mol∗Å2. A p.K533E variáns a szabad energia nettó 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2 -es növekedését okozza, ami destabilizálhatja a helyi régiót. Ez a tárgy stabilitása pozitív volt, ami azt jelzi, hogy bizonyos dinamikus változások valószínűsíthetőek egy molekuláris szimulációval a konformációs mintavételezéshez. Így megvizsgáltuk a helyi maradékokat, és megállapítottuk, hogy egy elektrosztatikus számítás hasznos lehet a funkcióváltozás magyarázatához. A molekulamodell a teljes szerkezet és annak változatos formája (3. a) ábra) a korszerű módszereinket használva, amelyeket létrehoztunk . A dimerikus modell kritikus a funkció szempontjából, és fontos kölcsönhatásokat mutat a mutáció helyén, amelyeket a variáns mutáció megzavar.
A variáns hely (p.K533E) közelében lévő 12 Å távolságon belüli helyi maradékok mindkét monomerből származó maradékokat tartalmaznak. A variánst tartalmazó monomer (1-es monomer, szürke szénatomok) a következő közeli 533-as pozíciójú maradékokkal rendelkezik: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 és K624 (3. ábra b). Ezt a változatos szerkezetet (p.Lys533Glu) elemeztük, és a helyi környezet egyenesebb zavarát jelezte a pozitív lizin (+) töltés negatív glutaminsavra (-) való átfordulása, ami meglehetősen zavaró volt a szomszédos töltött maradékokra (fent). Különösen a K624, E499 és Y532 maradékok kerültek különböző kölcsönhatásokba (3. ábra b)). Az aminosavankénti lokális ΔG nettó pozitív értéket növel, ami a zseb kedvezőtlen stabilitásának felel meg, és hosszabb dinamikára lenne szükség a teljes hatás meghatározásához, de várhatóan destabilizáló hatású. A K533E maradéknak érdekes kölcsönhatásai vannak a Q472, I474, I475 és E499 maradékkal. A K533E egy hélix-hélix régióban van, ahol töltött oldallánca kifelé helyezkedik el az ellentétes töltésű fajok felé; a szomszédos hélixekkel is van némi hélix-hélix kölcsönhatás (3(b) és 3(c) ábra). A változatban ugyanazok a maradékok érintettek, de több maradék, köztük a P534, P535 és K624 helyzete megváltozott (3(c) ábra). Ez a kölcsönhatás a helyi szerkezeti stabilitás dinamikus viselkedésének megváltozása miatt megváltozott funkciót okozhat (3. ábra c)). A további elemzéshez elektrosztatikai számításokat végeztünk (4. ábra). Különösen a K624, E499 és Y532 maradékok kerültek különböző kölcsönhatásokba (3(b) ábra). Az aminosavankénti lokális ΔG nettó pozitív értéket növel, ami a zseb kedvezőtlen stabilitásának felel meg, és hosszabb dinamikára lenne szükség a teljes hatás meghatározásához, de várhatóan destabilizáló hatású.
4.2. Dimerképződési hatások
Az elektrosztatika feltérképezését a Poisson-Boltzmann szolvatációs számítással végeztük el a teljes 745 aminosav szerkezetre. A változások hatása erősen kifejezett volt az elektrosztatikus eloszlásra, +3 KT/E határértékkel mindkét esetben. A WT részecske (mind a 745 aa) határozott töltéseloszlást mutat a K533 körül, amely kevés negatívan töltött régiót és nagy semleges zsebeket mutat a fent említett hélixekben található gazdag hidrofób maradékok miatt. Úgy tűnik, hogy a treoninmutáció megváltoztatja a töltések eloszlását, és a negatív töltések pozícióját távolabb helyezi egymástól, miközben növeli a semleges töltésű régiók méretét (4(a) és 4(b) ábra). A p.K533E lokális régió töltése a pozitív lizinmaradvány és a szomszédos glutaminsavmaradványok (6 Å-n belül) egymáshoz illeszkedik (4(b) ábra). Ezzel szemben a K533 maradék pozitív töltéssel rendelkezik, amelyet a 6 Å-n belüli maradékok, nevezetesen az E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 és K624 maradékok befolyásolnak (4(a) ábra) . Úgy tűnik, hogy a p.K533E variánsnak nincs hatása magára a dimerre (3. és 4. ábra), mivel a variáns a monomerek közötti határfelülettől távol helyezkedik el. Jelentős zavar keletkezik azonban a helyi környezetben, ahol a lizin natívan egy zsebbe illeszkedik a közeli, ellentétes töltésű maradékokkal, amelyek H-kötésekben és sóhíd kölcsönhatásokban vesznek részt, ami a glutaminsav helyettesítéséből származó negatív töltéssel elveszik (3. ábra)
5. Megbeszélés
Az AMN-ben szenvedő betegek számára a kezelési lehetőségek jelenleg korlátozottak. Az egérmodellekkel végzett legújabb kutatások azonban lehetséges megoldást jelentenek. X-ALD betegeknél a VLCFA-k felhalmozódását a gyökös oxigénfajok megnövekedett szintje kíséri. Ezek a gyökök mozgatják a betegség progresszióját, károsítják a szöveteket, és végül a neurológiai tünetek megjelenését okozzák. Az X-ALD analóg egereket sikeresen kezelték antioxidánsok keverékével, így a gyökök szintjét ellenőrzés alá vonták és megállították ezt a patogén folyamatot . Ha a későbbi kísérletek továbbra is ígéretesnek bizonyulnak, lehetséges, hogy a mi probandusunk és más AMN-betegek egy napon hasonló módon kezelhetők lesznek.
Bár a mi probandusunk az ABCD1 egy kevéssé ismert variánsával rendelkezett, esete nem különbözött jelentősen a tipikus AMN fenotípustól. A tünetek a húszas évei végén kezdődtek, ami jól illeszkedik a 20 és 40 év közötti elvárt életkori tartományba. Az AMN tipikusan a gerincvelő érintettségével jár, amit a vizsgálati személy MRI-felvételei is megerősítettek. Lábgyengesége és járási rendellenessége a betegségre jellemző, akárcsak a vizeletinkontinencia. A hányás és a hányinger a mellékvesekéreg-elégtelenséghez társul, míg a próbatevő beszéd- és mentális rendellenességei agyi elváltozásokkal hozhatók összefüggésbe . Ennek ellenére azt kell mondanunk, hogy egy olyan beteg, akinél ugyanaz az ABCD1 variáns fordul elő, mint a mi probandusunknál, különböző tünetekkel jelentkezhet. Az ABCD1 patogén variánsai ritkán vezetnek kiszámítható fenotípusokhoz – még akkor is, ha a családtagok azonos változatot birtokolnak .
A variánsok és a vad típus molekuláris modellezésére alkalmazott statisztikai mechanikai számításokból származó fehérjeinformatikák a vad típushoz viszonyítva egyértelmű jelzést adnak a normál fehérje viselkedésének molekuláris szintű diszfunkciójára, amely hatással lenne a funkcióra. Például azt találtuk, hogy a p.K533E variáns 2,321 kcal/aamolÅ2 nettó szabadenergia-növekedést okoz, ami destabilizálja a K533 maradéktól számított 12 Å-n belüli helyi régiót. A gerincmaradványok által mérsékelt helyi szerkezeti változás és a másodlagos szerkezet kölcsönhatás változásai (H-kötés hálózat nem látható) miatt lehetővé teszi a korrelált mozgás terjedését az egész szerkezetben, ami tovább frusztrálja a dimer megfelelő kialakulását.
Probandánk ABCD1 variánsának ritkasága miatt a kereskedelmi laboratórium nem volt képes a variánst magabiztosan patogénnek nevezni. Emellett a logisztikai kihívások és a probandus kis családmérete miatt a családi szegregációs elemzés nem volt kivitelezhető. Ennek eredményeképpen ezt a folyamatot nem tudtuk befejezni, hogy jobban megértsük a variánsának jelentőségét. Szerencsére a molekuláris modellezés újabb lehetőséget biztosított számunkra. A fehérje molekuláris modellezése alátámasztotta a gyanút, hogy ez a variáns klinikailag jelentős módon befolyásolja a fehérje működését. Minden gyanú nélkül állt fenn, hogy ez a variáns nem lett volna patogénnek minősítve, tekintettel a szerkezet durva megváltozására, amit a PIP-analízis is erősen alátámasztott.
6. Következtetés
Végeredményben egy olyan probandusról számolunk be, aki az ABCD1 egy ritka, c.1599G>T (p.Lys533Asn) variánsával rendelkezik. A variánsra vonatkozó információk hiánya megakadályozta a genetikai vizsgálatokat végző céget abban, hogy variánsát patogénnek minősítse, de a molekuláris töltések alapján úgy tűnik, hogy a fehérje ezen régiója jelentősen eltér az egyensúlytól (3. ábra (b)). A fehérjemodellezés hasznosítása olyan információkat is szolgáltatott, amelyeket be lehetett építeni a próbaidős nagyobb klinikai képébe. Ezenkívül e variáns patogenitásának egy példánya szerepel az ALD mutációs adatbázisban. Ezek a bizonyítékok együttesen lehetővé tették az AMN biztos diagnózisát. Próbaidősünknek az AMN tipikus tünetei voltak, de az ABCD1-ben rejlő fenotípusos variabilitás más X-ALD megjelenési formát eredményezhet más, e variánssal rendelkező egyéneknél.
Rövidítések
| ABCD1: | ATP-kötő kazetta, D alcsalád, 1. tag (gén) |
| VLCFA: | Nagyon hosszú láncú zsírsavak |
| X-ALD: | X-hez kötött adrenoleukodisztrófia |
| AMN: | Adrenomyeloneuropathia. |
Adatok elérhetősége
Az adatkészletek és anyagok részletesen a kéziratban találhatók.
Egyetértés
A követett eljárások összhangban voltak a humán kísérletekkel foglalkozó illetékes (intézményi és nemzeti) bizottság etikai normáival és a 2000-ben módosított 1975-ös Helsinki Nyilatkozattal (5). Minden betegtől tájékozott beleegyezést kaptunk a vizsgálatba való bekapcsolódáshoz.
Érdekütközések
Minden szerző kijelenti, hogy nincs összeférhetetlensége.
A szerzők hozzájárulása
A fenti szerzők mindegyike jelentősen hozzájárult a munka koncepciójához vagy tervezéséhez; vagy a munka adatainak megszerzéséhez, elemzéséhez vagy értelmezéséhez ÉS a munka megszövegezéséhez vagy kritikusan átdolgozta azt a fontos szellemi hozzájárulás miatt ÉS véglegesen jóváhagyta a publikálandó változatot ÉS vállalta, hogy a munka minden aspektusáért felelősséget vállal annak biztosításában, hogy a munka bármely részének pontosságával vagy integritásával kapcsolatos kérdéseket megfelelően kivizsgálják és megoldják.
Finanszírozás
A finanszírozást a Mayo Clinic Egyénre szabott Orvostudományi Központja biztosította, amely forrásokat biztosított a tanulmány elvégzéséhez.
Köszönet
TC köszönetet mond a Mayo Clinic Jacksonville Egyénre szabott Orvostudományi Központjának a kutatási támogatásért.