Az acetátot és acetil-CoA-t átalakító enzimek szabályozása acetáton és/vagy glükózon történő növekedés során a halofil Haloarcula marismortui archeonban | FEMS Microbiology Letters

Abstract

A Haloarcula marismortui a glükózon történő aerob növekedés során acetátot képzett és az acetátot növekedési szubsztrátként hasznosította. Glükóz/acetát keverékeken diaux növekedést figyeltek meg, ahol a glükóz volt a preferált szubsztrát. A glükóz- és acetát-anyagcseréhez kapcsolódó enzimaktivitások szabályozását elemeztük. Megállapítottuk, hogy mind a glükóz-dehidrogenáz (GDH), mind az ADP-t képző acetil-CoA-szintetáz (ACD) felszabályozódott a glükózfogyasztás és az acetátképződés időszakában, míg mind az AMP-t képző acetil-CoA-szintetáz (ACS), mind a malát-szintáz (MS) leszabályozódott. Ezzel szemben az ACS és az MS upregulációja, valamint az ACD és a GDH downregulációja volt megfigyelhető az acetátfogyasztás időszakában. Az MS szintén felfelé szabályozódott a peptideken történő növekedés során, acetát hiányában. Az adatokból arra következtetünk, hogy egy glükóz-indukálható ACD katalizálja az acetátképzést, míg az acetát aktiválását egy acetát-indukálható ACS katalizálja; mind az ACS-t, mind az MS-t nyilvánvalóan az acetát indukálja, és a glükóz elnyomja.

1 Bevezetés

Változatos halofil archaea, köztük a Haloarcula marismortui, glükózon nő, amelyet egy módosított, félfoszforilált Entner-Doudoroff (ED) útvonalon keresztül bontanak le . Kimutatták, hogy a glükózon történő exponenciális növekedés során jelentős mennyiségű acetát képződik . A legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy az acetát acetil-CoA-ból történő képződését a halofil archeákban egy ADP-képző acetil-CoA-szintetáz (ACD) katalizálja (acetil-CoA + ADP + Pi⇆ acetát + ATP + CoA). Ez a szokatlan szintetáz minden acetátképző archaea-ban megtalálható volt, beleértve az anaerob hipertermofilokat is, és az acetátképzés és ATP-szintézis új mechanizmusát képviseli a prokariótákban. Az anaerob hipertermofil archeákban, pl. a Pyrococcus furiosusban az ACD a cukor-, piruvát- és peptidanyagcsere során a fő energiatakarékos reakciót jelenti. Az archeális egyenzimes mechanizmussal ellentétben minden baktérium a “klasszikus” kétenzimes mechanizmust használja az acetil-CoA acetáttá történő átalakítására, amelyben foszfát-acetiltranszferáz (PTA) és acetát-kináz (AK) vesz részt .

Egyes haloarchaea, köztük a H. marismortui, Haloferax volcanii és Halorubrum saccharovorum esetében jelentették, hogy acetáton mint szubsztráton növekednek. Az acetát metabolizmusa az acetil-CoA-vá történő aktiválásával kezdődik. A közelmúltban szolgáltattuk az első bizonyítékot arra, hogy az acetát acetil-CoA-vá történő aktiválását a haloarchaea-kban egy AMP-t képző acetil-CoA-szintetáz (ACS) katalizálja (acetát + ATP + CoA → acetil-CoA + AMP + PPi) . Az ACS az acetát-aktiválás fő enzime a legtöbb acetát-felhasználó szervezet számára az élet mindhárom területéről . Csak néhány baktérium, pl. a Corynebacterium glutamicum, valamint az acetoklasztikus metanogén archeon Methanosarcina ssp. aktiválja az acetátot acetil-CoA-vá az AK/PTA-páron keresztül . Az AK/PTA útvonal tehát in vivo reverzibilisen működhet, azaz mind az acetátképződés, mind az acetátaktiválás irányába. Ezzel szemben az első elemzések arra utalnak, hogy a haloarchaea-ban az ACD, az AK/PTA-pár archeális megfelelője in vivo az acetátképződés irányában működik, bár az enzim in vitro reverzibilis reakciót katalizál.

A fiziológiai szerep további tisztázása érdekében, és hogy első betekintést nyerjünk az acetátot és acetil-CoA-t konvertáló enzimek szubsztrátfüggő szabályozásába haloarchaea-ban, szubsztrátváltási kísérleteket végeztünk H. marismortui-val, és glükózon, acetáton, glükóz/acetát keverékeken és peptideken történő növekedést elemeztünk. A növekedés során az acetátot és acetil-CoA-t konvertáló enzimek, az ACD és ACS, valamint a glükóz-dehidrogenáz, a módosított ED útvonalon keresztül történő glükózlebontás első enzimjének aktivitási profilját elemeztük. Ezenkívül meghatároztuk a malát-szintáz, a glioxilát-ciklus egyik kulcsenzimének aktivitását is, amelyről azt javasolják, hogy a haloarchaea-ban is működik.

2 Anyagok és módszerek

2.1 A H. marismortui termesztése glükózon, acetáton, glükóz/acetát keverékeken és peptideken

Haloarcula marismortui-t aerob módon 37 °C-on, élesztőkivonatot, kazaminosavakat és ezen felül glükózt és/vagy acetátot tartalmazó komplex táptalajon növesztettük a korábban leírtak szerint . A glükóz/acetát keveréken történő növekedéshez ezt a táptalajt 12,5 mM glükózzal és 30 mM acetáttal egészítettük ki. A peptideken való növekedést a komplex táptalajon végeztük acetát és glükóz hiányában. A növekedési kísérleteket 2 literes fermentorokban (fairmen tec, Németország) végeztük 500 rpm keverési sebességgel és 600 ml/perces sűrített levegőteljesítménnyel. A növekedést az 578 nm-en mért optikai sűrűség (ΔOD578) mérésével követtük. Az 1-es ΔOD578 0,5-0,6 mg/ml fehérjetartalomnak felelt meg. A glükózt és az acetátot enzimatikusan határoztuk meg a .

2.2. Sejtkivonatok készítése

A H. marismortui sejtjeit (100-200 ml tenyészetből) különböző növekedési fázisokban begyűjtöttük, és a sejtkivonatokat a .

pontban leírtak szerint készítettük el. A fehérjéket a Bradford-módszerrel határoztuk meg, standardként szarvasmarha-szérumalbumin felhasználásával.

2.3 Az enzimaktivitások meghatározása

Minden enzimvizsgálatot aerob körülmények között, 37 °C-on, 1 ml vizsgálati keverékkel töltött küvettákban végeztünk. A segédenzimeket általában röviddel a reakció megkezdése előtt adtuk hozzá, és biztosítottuk, hogy ezek az enzimek ne legyenek sebességkorlátozóak. Az enzimaktivitás egy egységét (1 U) a percenként elfogyasztott 1 μmol szubsztrátként vagy képződött termékként definiáltuk.

• Acetil-CoA szintetáz (ADP-képző) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) mérése a .

• Acetil-CoA szintetáz (AMP-képző) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) PPi és AMP-függő HSCoA felszabadulását acetil-CoA-ból Srere et al. szerint Ellman tioolreagenssel, 5′5-ditióbisz (2-nitrobenzoesav) (DTNB) segítségével követtük nyomon, a 412 nm-en történő tiofenolát-anion képződésének mérésével (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). A vizsgálati elegy 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetil-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi és kivonatot tartalmazott.

• A malát-szintáz (E.C. 4.1.3.2.) működését Serrano és munkatársai szerint módosított, DTNB-vel végzett vizsgálatban követtük nyomon. A próbakeverék 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetil-CoA, 0,5 mM glioxilát és kivonatot tartalmazott.

• A glükóz-dehidrogenáz (E.C. 1.1.1.1.47) mérése a Johnsen et al. szerint történt. .

• Acetát-kináz (E.C. 2.7.2.1.) mérése a .

• Foszfotranszacetiláz (E.C. 2.3.1.8.) mérése a Pi függő HSCoA felszabadulásként történt az acetil-CoA-ból DTNB-vel . A vizsgálati elegy 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetil-CoA, 5 mM KH2PO4 és kivonatot tartalmazott.

3 Eredmények

Az acetát és acetil-CoA anyagcseréhez kapcsolódó enzimek élettani működésének és szabályozásának vizsgálatához a H. marismortui különböző szubsztrátokon előnevelt sejtjeit acetátot és/vagy glükózt, illetve peptideket tartalmazó táptalajra helyeztük át, és elemeztük az ACD, ACS, GDH és MS aktivitási profilját.

3.1 Az acetátra adaptált sejtek növekedése glükózon

A lag fázis után a sejtek exponenciálisan növekedtek, és a glükóz teljesen elfogyott. A glükózfogyasztással párhuzamosan jelentős mennyiségű acetát képződött. Ebben az időszakban mind a GDH, mind az ACD aktivitása nőtt, míg az acetát adaptált sejtekben aktív ACS és MS aktivitása teljesen lecsökkent. A stacionárius fázisban a kivált acetát teljesen visszaszívódott, és mind az ACS, mind az MS aktivitása nőtt, míg a GDH és az ACD aktivitása csökkent (1. ábra).

3.2 Glükózzal adaptált sejtek növekedése acetáton

A glükózzal adaptált sejtek kezdetben (kb. 30 óra) acetát tartalmú táptalajon növekedtek, 10 órás megduplázódási idővel, egészen 1 optikai sűrűségig (ΔOD578). Ebben a növekedési fázisban nem volt megfigyelhető acetátfogyasztás, és a sejtek a táptalajban lévő peptideken növekedtek. Ezt követően a sejtek csökkent növekedési sebességgel növekedtek 1,8 ΔOD578 értékig, és az acetát teljesen elfogyott. Az acetátfogyasztás során az ACD és GDH aktivitás csökkent, míg az ACS és MS aktivitás, amely a glükózhoz adaptált sejtekben nem volt kimutatható, nőtt. Az MS aktivitás növekedése a peptideken való növekedés során kezdődött, míg az ACS aktivitás növekedése az acetátfogyasztással párhuzamosan zajlott (2. ábra).

3.3. Növekedés glükóz/acetát keveréken

A H. marismortui élesztőkivonathoz és kazaminosavakhoz adaptált sejtjeit glükózt és acetátot egyaránt tartalmazó táptalajra helyeztük át. A sejtek diauxikus növekedést mutattak az első glükóz és a második acetát egymás utáni felhasználásával. Az első növekedési fázisban a sejtek 4,0 ΔOD578 értékig növekedtek, és a glükózt fogyasztották. A glükózfogyasztás és egy rövid lag-fázis után a sejtek a második növekedési fázisba léptek, amelyben az acetát metabolizálódott, és a sejtek 5,2-es végső ΔOD578 értékig növekedtek. A glükózfogyasztással párhuzamos első növekedési fázisban az ACD és a GDH aktivitása nőtt, míg az ACS aktivitása nem volt kimutatható, az MS aktivitása pedig teljesen lecsökkent. Az acetát felhasználással párhuzamos második növekedési fázisban az ACS és MS aktivitás nőtt, az ACD és GDH aktivitás pedig csökkent (3. ábra).

3.4 Glükózhoz adaptált sejtek peptideken

A glükózhoz adaptált sejteket glükóz és acetát hiányában 0,25% élesztőkivonatot és 0,5% kaszaminosavat tartalmazó táptalajra helyeztük át. A sejtek 13 órás megduplázódási idővel 2,5 ΔOD578 értékig növekedtek. Acetátképződés nem volt kimutatható. Az exponenciális növekedés során az ACD (60 mU/mg-ról 20 mU/mg-ra) és a GDH (80 mU/mg-ról 40 mU/mg-ra) csökkent, az MS aktivitás, amely kezdetben nem volt kimutatható, 20 mU/mg-ig nőtt. Az ACS aktivitása az exponenciális növekedési fázisban nem volt kimutatható, de a stacionárius fázisban nőtt (13 mU/mg).

4 Megbeszélés

Ezzel a cikkel az acetát és acetil-CoA konvertáló enzimek (ACD, ACS) élettani szerepét elemeztük a H. marismortui-ban, és első bizonyítékot adunk ezen enzimek, valamint a GDH és MS szubsztrátspecifikus szabályozására. Az adatokat ismert bakteriális rendszerekkel összehasonlítva tárgyaljuk.

4.1 Az acetátképzést a H. marismortui-ban az ACD katalizálja a “túlfolyásos” anyagcsere részeként

A glükózon és glükóz/acetát keverékeken történő növekedés során mind az ACD, mind a GDH aktivitása a glükózfogyasztás és az acetátképzés fázisaival párhuzamosan nőtt (1. és 3. ábra). Ezzel szemben mindkét aktivitás csökkent az acetáton vagy peptideken történő növekedés során. Ezek az adatok és az AK/PTA hiánya arra utalnak, hogy az acetátképződést Haloarculában az ACD katalizálja. Az acetátképződés fiziológiai szerepe a H. marismortui-ban és annak szabályozása a glükózon történő aerob növekedés során nem ismert; az acetátképződés egy “túlfolyásos” anyagcsere része lehet, amelyet különböző baktériumokban, pl. az Escherichia coli-ban és a Bacillus subtilis-ben már részletesen tanulmányoztak. A H. marismortui-hoz hasonlóan mindkét baktérium kiválasztja az acetátot a glükózfelesleggel történő aerob növekedés során, és a stacionárius fázisban újrahasznosítja azt. Feltételezések szerint az acetát kiválasztása olyan körülmények között történik, amikor a glikolízis sebessége meghaladja a későbbi útvonalak, pl. a citromsavciklus és a glükóz teljes oxidációjához szükséges légzés sebességét . Ilyen körülmények között az acetil-CoA acetáttá alakul és kiválasztódik. Ezzel a nézettel összhangban az E. coli és a B. subtilis transzkripciós elemzései a glikolitikus gének glükóz-specifikus indukcióját és a citromsavciklus és a légzés génjeinek represszióját jelzik . Hasonló glükózspecifikus transzkripciós szabályozásról, azaz a módosított Entner-Doudoroff-útvonal glikolitikus génjeinek felszabályozásáról és a citromsavciklus és a légzés egyes génjeinek downregulációjáról számoltak be nemrégiben a H. volcanii halofil archeon esetében. Így a haloarchaeákban valószínűsíthető egy glükózspecifikus, acetátképződést eredményező túlfolyásos anyagcsere. Az acetátképződés az E. coliban és a B. subtilisben a bakteriális két enzimes mechanizmust alkalmazza a PTA és az AK révén, míg a Haloarculában az acetátképződést az ACD, az archeális egyenzimes mechanizmus katalizálja. Mind az E. coliban, mind a B. subtilisben a glükóz indukálja a pta és az AK gént kódoló géneket, ami a glikolízis és az acetátképződés koordinált szabályozására utal. Eddig nem elemezték az acetátképző ACD transzkripciós szabályozását a H. marismortui archeonban. A GDH és az ACD aktivitás koordinált szabályozása azonban arra utal, hogy mind a glikolízisnek a módosított Entner-Doudoroff útvonal, mind az acetátképzésnek az ACD által történő hasonló glükózspecifikus transzkripciós szabályozására utal.

Aerob növekedés során a H. marismortui peptideken nem képzett acetátot és az ACD aktivitása le volt szabályozva. Ebben a tekintetben a Haloarcula különbözik az E. coli, amely a peptideken történő aerob növekedés során jelentős mennyiségű acetátot képez a “túlfolyó” anyagcsere során. A H. marismortui különbözik a P. furiosus anaerob hipertermofil archeától és más anaerob, hipertermofil archeáktól is, amelyek nagy mennyiségű acetátot képeznek az ACD segítségével az anaerob növekedés során mind cukrokon, mind peptideken. A P. furiosus anaerob peptid- és cukorfermentációja során az ACD általi acetátképződés a szubsztrátszintű foszforiláció révén történő ATP-képződés fő helyszíne ; ezzel szemben a H. marismortui aerob cukor- és peptidlebontása során a legtöbb energiát a légzési lánc elektrontranszport-foszforilációja tartja fenn, és így az ACD általi acetátképződés kevésbé fontos vagy nélkülözhető. Úgy tűnik tehát, hogy a Haloarculában az ACD általi acetátképződés a cukoranyagcserére korlátozódik egy “túlfolyó” anyagcsere során.

4.2 Az acetát acetil-CoA-vá történő aktiválását a H. marismortui-ban az ACS katalizálja

Az ACS-aktivitás acetátfogyasztással párhuzamos felszabályozásából erre következtettünk (1., 2., 3. ábra). Az ACD szerepe az acetát-aktiválásban kizárható volt, mivel az ACD az acetátfogyasztás időszakaiban downregulált volt. Így az ACD a Haloarculában in vivo csak az acetátképződés irányában működik. Az ACD az acetátaktiválás leggyakoribb mechanizmusa a baktériumokban is, ahol szigorúan szabályozott; pl. E. coliban és B. subtilisben az acetát indukálja az acs gént, a glükóz pedig elnyomja . A Haloarculában az ACS-aktivitás acetát általi felszabályozása és glükóz általi leszabályozása arra utal, hogy a baktériumokhoz hasonló transzkripciós szintű szabályozásról számoltak be. Meg kell jegyezni, hogy az E. colival és a B. subtilisszel ellentétben a C. glutamicum baktérium az acetátot egy acetát indukálta AK/PTA útvonalon keresztül aktiválja .

A glioxilát-ciklus egyik kulcsenzimének, az MS-nek az aktivitása a H. marismortui-ban az acetátfogyasztás időszakában az ACS-szel együtt felszabályozódott, ami az ACS és az anaplerotikus glioxilát-ciklus acetát-specifikus koordinált szabályozására utal. Mind az MS, mind az ACS aktivitását a glükóz lefelé szabályozta. Az acetát-aktiváló enzimek (lásd fentebb) és a glioxilát-útvonal génjeinek koordinált acetát-specifikus indukciójáról már több baktérium, köztük az E. coli és a C. glutamicum esetében is beszámoltak. A közelmúltban a H. volcanii halofil archeon esetében adtak első bizonyítékot mind a malát-szintáz, mind az izocitrát-liáz gének acetát általi indukciójára.

Az ACS aktivitás helyett azonban az MS aktivitás is felszabályozódott peptideken történő exponenciális növekedés során, acetát hiányában, ami arra utal, hogy az MS szabályozása összetettebb és nem korlátozódik az acetátra. Az MS (és a glioxilát-ciklus) szerepe a peptidanyagcserében azzal magyarázható, hogy sok aminosav acetil-CoA-ra bomlik le, amihez az anabolizmushoz egy működő glioxilát-útvonalra lenne szükség. A peptideken való növekedés során az állófázisban megfigyelt ACS-aktivitás növekedése egyelőre nem magyarázható, ez az állófázisú sejtek általános stresszválaszának lehet az oka .

4.3 Glükóz-specifikus katabolit represszió H. marismortui-ban

Haloarcula marismortui diaux növekedést mutatott glükóz/acetát keverékeken glükózzal mint preferált szubsztráttal, ami az acetát hasznosításának valamiféle katabolikus elnyomására utal a glükóz által. A glükózspecifikus katabolit-repressziót eddig nem vizsgálták archaea-kban. Baktériumokban részletesen tanulmányozták a szén katabolit glükóz általi elnyomásának molekuláris alapjait, pl. E. coli és B. subtilis esetében. A C. glutamicum glükóz/acetát keverékeken történő növekedése során monofázisos növekedést írtak le az acetát és a glükóz egyidejű fogyasztásával, míg az Azotobacter vinelandii-ben az acetát a preferált szubsztrát. Az e tulajdonságok mögött meghúzódó szabályozási elveket jelenleg vizsgálják .

Az acetátképző és acetátaktiváló enzimek, az ACD és az ACS javasolt szubsztrátspecifikus szabályozásának alátámasztásához további vizsgálatok szükségesek az acetát- és glükóz-anyagcserével kapcsolatban, transzkripciós szinten. Ezek a vizsgálatok, amelyekhez a H. marismortui-ből származó ACD és ACS kódoló génjeinek tisztítása és azonosítása szükséges, folyamatban vannak.

(

)

-ban.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

-ban.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

Author notes