Az in vitro vizsgálatokból tanult összeszerelési elvek
A funkcionális bakteriális 30S és 50S riboszómális alegységek in vitro rekonstruálhatók az rRNS-ből és az egyes riboszómális fehérjékből. A riboszóma in vitro összeszerelésének alapjául szolgáló biokémiai és biofizikai elvek részletes vizsgálata hasznos paradigmákat szolgáltatott a riboszóma biogenezisének in vivo vizsgálataihoz.
Az egyik első, e kísérletek által feltárt elv, hogy az r-fehérjék riboszómális alegységgé való összeszerelése hierarchikus módon történik. A bakteriális 30S riboszóma alegységek rekonstitúciós vizsgálatai egy “összeszerelési térképet” határoztak meg az egyes r-fehérjék rRNS-hez való kapcsolódásának sorrendjére vonatkozóan. A kötési hierarchiában elfoglalt sorrendjük alapján az r-fehérjéket elsődleges (közvetlenül kötődnek az rRNS-hez), másodlagos (a kötés az elsődleges kötőfehérjéktől függ) vagy harmadlagos (a kötés a másodlagos kötőfehérjéktől függ) fehérjéknek nevezzük. Bár egy ilyen függőségi térkép nagyon hasznos kiindulópontnak bizonyult, nem nyújt információt a fehérjék kötődésének kinetikájáról. Inkább az összeszerződés útja tükrözheti nagyrészt azt a sorrendet, amelyben az egyes r-fehérjék a legstabilabban kapcsolódnak az rRNS-hez. Ezenkívül az összeszerelési térkép nem veszi figyelembe sem a 16S rRNS r-fehérjéktől független hajtogatási útját, sem az rRNS prekurzorok in vivo zajló nukleolitikus feldolgozásának a riboszóma összeszerelésében betöltött szerepét. A közelmúltban a 30S alegység összeszerelésének ezen aspektusait részletesebben vizsgálták olyan technikák segítségével, mint az RNS-konformáció kémiai és hidroxilgyökös szondázása az rRNP-konformáció időbeli változásainak vizsgálatára, valamint az r-fehérjék rRNS-hez való kötődésének kinetikájának meghatározására szolgáló impulzuskeresés/masszaspektrometria (PC/MS).
Az elsődlegesen kötő r-fehérjék megfigyelésére az összeszerelési térképen az a lehetséges magyarázat, hogy kötőhelyeiket legalább részben a 16S rRNS által az r-fehérjéktől függetlenül felvett konformáció hozza létre. Valójában, összhangban ezzel az elképzeléssel és azzal a nézettel, hogy a riboszómák egy RNS-katalizátorból fejlődtek ki, kimutatták, hogy a 16S rRNS 5′-doménje minden r-fehérje hiányában is képes összehajolni és tercier kapcsolatokat kialakítani. Ez a tercier szerkezet feltehetően nem teljesen stabil a fehérjekapcsolatok hiányában, és így valószínűleg az r-fehérjék kötődése stabilizálja az rRNS által a hajtogatás során felvett átmeneti konformációk által létrehozott helyeken. Ezért a második elv azt sugallja, hogy az rRNS hajtogatása biztosítja az r-fehérje kötődésének alapját a riboszóma összeszerelése során.
A bakteriális riboszómák in vitro vizsgálataiból kiderült harmadik elv az, hogy az r-fehérje és az rRNS közötti kötődés erősödése a riboszóma összeszerelésének előrehaladtával történik. Sok r-fehérje több nukleotiddal érintkezik az rRNS-en. Az időben felbontott hidroxilgyök lábnyomok kimutatták, hogy ezek közül néhány nukleotid előbb védetté válik, mint mások, ami arra utal, hogy a riboszóma biogenezis előrehaladtával az r-fehérjék több kapcsolatot létesítenek az rRNS-szel, ezáltal stabilabban integrálódnak a riboszómákba.
Az r-fehérjék és az rRNS közötti néhány kapcsolat kezdeti létrehozása potenciálisan stabilizál bizonyos RNS-konformációkat, és olyan változásokat indukál az rRNS-konformációban, amelyek további (másodlagos vagy harmadlagos) r-fehérjék számára biztosítanak kötőhelyeket. Ezért az r-fehérje kötődés megszilárdítja az RNS-összehajtási nyereséget, és irányítottságot kölcsönöz az összeszerelési folyamatnak. Ez egy olyan modellt sugall, amelyben az összeszerelés az RNS konformációs változásainak és a fehérjék kötődésének váltakozó sorozatán keresztül zajlik, amelyek egymás után stabilizálják a végső RNS-szerkezetet. A kinetikai adatok kimutatták, hogy az érett 30S alegységek összeszerelése több, párhuzamos RNS-összehajtási útvonalon keresztül történik, amelyek mindegyike a végtermékhez konvergál. Ez vezetett az összeszerelési tájkép fogalmához, szemben egy egyedi útvonallal, amelyen a riboszómális alegységek összeszerelése végbemegy.
Végezetül, in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a riboszóma összeszerelése 5′ és 3′ irányban történik. Az rRNS másodlagos szerkezetének PC/MS és kémiai szondázása azt mutatta, hogy az r-fehérje kötődése az rRNS 5′ doménjéhez még azelőtt megfigyelhető, hogy a fehérje kontaktusokat létesítene az rRNS 3′ doménjével. Ezzel szemben a hidroxilgyök lábnyomvizsgálatok a nukleotidok védelmének kezdeti kirobbanását mutatták az egész 16S rRNS mentén, ami arra utal, hogy az RNS-összehajtás sok különböző, az RNS-ben szétszórt helyről indul, és így az 5′-3′-irányúság hiányára utal az összeszerelésben. Ezek az egymásnak ellentmondó megfigyelések összeegyeztethetők, ha figyelembe vesszük a különböző kísérleti elrendezések jellegét. A PC/MS a fehérjék rRNS-hez való kötődésének kinetikáját méri, és mint ilyen, csak stabil r-fehérje-rRNS kölcsönhatások mutathatók ki, mivel az impulzus során gyengén kötődő r-fehérjék az üldözés során kimosódhatnak. Ezzel szemben a footprinting vizsgálatok mind a gyengén kölcsönható, mind a stabilan kötődő r-fehérjék által nyújtott nukleotidvédelmet meg tudják ragadni. Ezek az adatok együttesen azt jelzik, hogy bár a riboszóma összeszerelődése az egész rRNS-en keresztül nukleálódhat, az r-fehérjék végső szoros társulása az rRNS-hez 5′ és 3′ irányban történik.
Nem mindegy, hogy ezek az in vitro kísérletek hogyan tükrözik vagy nem tükrözik az in vivo összeszerelődést. Például, amikor a riboszóma összeszerelése in vivo történik, az rRNS átírásával párosul, ami feltehetően szintén hozzájárul az r-fehérjék asszociációjának megfigyelt 5′ – 3′ irányúságához. Az rRNS úgy fejlődhetett ki, hogy szintézis közben 5′ – 3′ irányba hajlik, és így építi be az r-fehérjéket, ezáltal összekapcsolva az összeszerelést az rRNS átírásával. Továbbá, a riboszómális alegységek in vitro rekonstitúciója során a melegítési lépés követelménye és számos olyan bakteriális mutáns azonosítása, amelyek hibásak a riboszómák előállításában, arra utal, hogy a riboszóma biogenezis során in vivo transz-hatású faktorokra van szükség.