Biosynthesis of trans-4-hidroxiprolin előállítása Corynebacterium glutamicum és Escherichia coli rekombináns törzsekkel

Transz-Hyp termelő rekombináns törzsek előállítása

Az adatbázisban több gént is feltételezett L-prolin 4-hidroxiláz génként tartanak számon, beleértve a Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 és Dactylosporangium. sp. PCR segítségével klónoztuk és nyertük a P4H feltételezett génjeit a P. stutzerből és a B. bronchiseptica RB50-ből, amelyeket p4hP-nek és p4hB-nek neveztünk el. Ezeket emésztés után a megfelelő plazmidokhoz ligáltuk, és C. glutamicumba, illetve E. coliba konvertáltuk. A p4hP hossza 918 bps, míg a p4hB hossza 924 bps volt. Ezek a szekvenciák 100%-ban megegyeztek az NCBI-ban közölt génekkel. A Dactylosporangium sp. transz-P4H génjét (p4hD) sikeresen expresszálták E. coli-ban, és jó enzimatikus tulajdonságokkal képes L-prolint átalakítani. A p4hD hossza 816 bps volt, amely egy 272 aminosavból álló, 29 715 dalton molekulatömegű polipeptidet kódolt . Ebben a tanulmányban a p4hD-t a nukleáris bázisok némi módosításával alkalmazták. A p4hD eredeti génszekvenciáját elemezték (http://www.kazusa.or.jp/codon/), és az eredmények azt mutatták, hogy mind a C. glutamicum, mind az E. coli esetében volt néhány ritka kodon. Arról számoltak be, hogy a ritka kodonok erősen összefüggnek az alacsony szintű fehérjeexpresszióval . A heterológ fehérje kifejeződéséhez szükséges kodonoptimalizálás gyakran kimutatták, hogy drasztikusan növeli a fehérje kifejeződését . Így a p4hD gén ritka kodonjait a C. glutamicumban nagy gyakorisággal használt kodonokkal helyettesítettük, és a GC-tartalmat 73%-ról 61%-ra állítottuk be szinonim átalakítással, ami közel állt a C. glutamicuméhoz. A p4hD módosított génjét a fenti módosításoknak megfelelően szintetizáltuk (Additional file 1).

A P4H expressziója az egyik fontos szempont a transz-Hyp bioszintetikus útvonal felépítésében. A 2. ábra a rekombináns C. glutamicumban és E. coliban expresszált transz-P4H-k SDS-PAGE-ját mutatja. Az összes rekombináns transz-P4H-t szolubilis fehérjeként fejezték ki, zárványtestek nélkül. Nyilvánvaló volt, hogy az E. coliban lévő rekombináns transz-P4H-k sokkal nagyobb mennyiségben fejeződtek ki, mint a C. glutamicumban lévők (2. ábra). Számos tényező befolyásolja az idegen fehérjék expresszióját, beleértve a promótereket, a gazdatest-vektor rendszert és a kulturális körülményeket stb. Mivel ez volt az első transz-P4H-k expressziója C. glutamicumban, a jövőbeni munkánk során átfogóbb vizsgálatokat, például a promóterek kiválasztását és a tenyésztési feltételek optimalizálását fogjuk figyelembe venni.

P4H aktivitások összehasonlítása

Az oxigenázokat széles körben alkalmazzák az iparban, mivel enyhe körülmények között képesek katalizálni a nem aktivált C-H kötések igen specifikus oxifunkcionalizálását, különösen a molekuláris oxigén szubsztrátra történő átvitelét . A P4H a 2-oxosav-függő dioxygenázok családjába tartozik, amely monomer fehérje, és inkább a monomer, mint a polimer szubsztrátokat hasznosítja . Ebben a tanulmányban a transz-P4H-k aktivitását rekombináns teljes sejtek felhasználásával mértük (1. táblázat). Adataink azt mutatták, hogy az expresszált fehérjeszint és az enzimatikus aktivitás 30°C-on magasabb volt. Az eredmények azt is mutatták, hogy a plazmidok nagyon stabilak voltak, mivel a rekombináns E. coli és C. glutamicum törzsek plazmidstabilitása a fermentáció végén mind több mint 98% volt.

A különböző géneket expresszáló rekombináns sejtek különböző szintű katalitikus aktivitást mutattak az L-prolinnal szemben. Az E. coli BL21/ pET28a-p4hD által expresszált transz-P4H aktivitása volt a legmagasabb az összes konstruált rekombináns törzs közül. A P. stutzeri és a B. bronchiseptica újonnan klónozott és expresszált génjei szintén érdekes aktivitást mutattak. Ami a különböző gazdatörzseket illeti, az E. coli jobban szerepelt, mint a C. glutamicum, ami összefügghet a megfelelő plazmid teljesítményével. A C. glutamicum négy L-prolint termelő törzsét használtuk expressziós gazdatörzsként, és az így kapott rekombináns törzsek különböző enzimaktivitást mutattak. A C. glutamicum törzsek közül a C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB enzimaktivitása volt a legmagasabb, 40,7 U/mg – nedves sejt. A rekombináns E. coli/pET28a -p4hD specifikus enzimaktivitása azonban elérte a 60,4 U/mg – nedves sejtet. A három rekombináns E. coli törzs növekedése hasonló volt. A rekombináns C. glutamicum törzsek között azonban jelentős különbség volt. A magasabb specifikus enzimaktivitású rekombináns C. glutamicum törzsek kevésbé növekedtek, mint az alacsonyabb specifikus enzimaktivitásúak. Ezenkívül az E. coli BL21 /pET28a -p4hD enzimaktivitása hasonló volt az E. coli W1485/pWFH1 enzimaktivitásához és magasabb, mint az E. coli BL21/pET24-p4h1 enzimaktivitása. Az E. coli W1485/pWFH1 p4hD a Dactylosporangium sp. eredeti p4hD-je volt, míg az E. coli BL21/pET24-p4h1 p4hD-je módosított volt. Bár ebben a vizsgálatban a kodonoptimalizálást C. glutamicumra tervezték, az eredmények azt mutatták, hogy E. coliban is sikeresen működött.

Transz-Hyp termelés lombikban

A transz-Hyp termelését különböző rekombináns C. glutamicum és E. coli törzsek által az 1. táblázat is mutatja. A transz-Hyp hozama ezekkel a rekombináns törzsekkel mind a P4H enzimaktivitásától, mind a sejtnövekedéstől függött. Az E. coli BL21/ pET28a-p4hD esetében volt a legnagyobb a hozam, ami egybeesett a specifikus enzimaktivitással. Bár a rekombináns E. coli törzsek hasonlóan növekedtek a termelőközegben, jelentős különbség volt a transz-Hyp termelésében, amely nem tartotta ugyanazt a szintet a specifikus enzimaktivitással. A rekombináns C. glutamicum törzsek transz-Hyp termelése is sokkal kisebb volt, mint az E. coli BL21/pET28a-p4hD-é. Ez mind a transz-P4H kisebb expressziójának, mind a C. glutamicum kisebb sejtnövekedésének volt köszönhető. A négy C. glutamicum törzs L-prolintermelése szintén kevesebb volt, mint 1 g/l. Az azonos p4hD génnel rendelkező rekombináns C. glutamicum törzsek között a transz-Hyp-termelésben nem volt nagy különbség, annak ellenére, hogy egyes törzsek enzimatikus teljesítménye és prolintermelése jobb volt.

A rekombináns törzsek felhasználása a transz-Hyp közvetlen szintézisére glükózból fermentáció útján sikerült, mivel mind az enzimek, mind a folyamathoz szükséges prekurzorok rendelkezésre álltak. A túlexprimált idegen transz-P4H-k katalizálták az L-prolin hidroxilálását a transz-4 pozícióban, míg a 2- ketoglutarátot a TCA-cikluson keresztül a glükóz szolgáltatta, majd oxidatív módon szukcináttá dekarboxilálódott (1. ábra). Arról számoltak be, hogy csak a p4h génnel rendelkező rekombináns E. coli által termelt Hyp előállításához prolinra volt szükség. A fermentáció során hozzáadott prolinban lévő szén csak a TCA-ciklus intermedierjeiből szintetizált aminosavakba áramlott, a glükoneogenezisbe nem . A felhalmozott Hyp azonban ebben a vizsgálatban prolin hozzáadása nélkül is viszonylag magas szinten volt. Meg lehetett érteni, hogy a Corynebacterium rendelkezett a prolin erőteljes bioszintetikus útvonalával . A prolin bioszintetikus útvonalát E. coli-ban is azonosították, ami hozzájárulhat a transz-Hyp szintéziséhez rekombináns E. coli törzsek által. A prolin útvonal módosítása E. coli-ban növelte a Hyp hozamát, míg a Hyp képződése enyhítheti a prolin visszacsatolt gátlását is . A prolin mennyisége (0-4 mM) elősegítette a transz-Hyp termelését. Az L-prolin folyamatos hozzáadása azonban nem javította jelentősen a termelés hozamát (2. táblázat). Ebben a vizsgálatban a tenyésztési idő jelentősen kevesebb volt, mint a szakirodalomban leírtak, ami az alkalmazott eltérő táptalajoknak tulajdonítható, és azt is jelezte, hogy nagy lehetőség van az optimalizálásban. Valójában 2,28 g/l transz-Hyp-et termeltek rekombináns E. coli-val L-prolin hozzáadása nélkül lombikokban, a közegek kis módosításával, és 6,72 g/l-t értek el mindössze 4 mM L-prolin kiegészítésével.

A transz-Hyp rekombináns C. glutamicum és E. coli által történő bioszintézisének további növelése érdekében alternatív megközelítéseket is meg kell fontolni. E. coliban a prolin lebontását kell legyőzni. Bár az E. coli putA mutánsával történő transz-Hyp-termelés nem javult tovább, a felhasznált prolinon alapuló hozam nagymértékben javult. Mind a C. glutamicumban, mind az E. coliban a rekombináns P4H mint az egyik oxigenáz expressziója részt vesz a gazdasejtek fiziológiai anyagcseréjében, beleértve a kofaktort, a ko-szubsztrátot és az oxigént. Ráadásul az E. coliban egy erős prolin szintetikus útvonal nélkül a szubsztrát elérhetősége és szállítása komolyan korlátozza a transzformációt.