Frontiers in Pharmacology

Introduction

A természetes gyógymódok használata ősi hagyomány, amely még mindig gyakorlatban van, a világ lakosságának >60%-a különböző egészségügyi problémákat, beleértve a rákot is, a hagyományos orvoslással kezel, mint első választással (Sultana et al., 2014). A rák kezelése azonban összetett, és a betegek jelenlegi lehetőségei a rák típusától és stádiumától, valamint a beteg korától, nemétől és általános egészségi állapotától függnek. Bár a kemoterápia általában sikeres a rák korai szakaszában, hatékonysága a gyógyszer beadási sémájától és a beteg fiziológiai állapotától függ. Mindazonáltal a kemoterápiával kapcsolatban a fő gondot a toxicitás jelenti, mivel az alkalmazott gyógyszerek általában a rákos sejteket és a normál sejteket is érintik, a magas proliferációs index pedig járulékos károkat okoz a betegeknél. Ráadásul a rákos sejtek rezisztenciát fejleszthetnek ki a kezeléssel szemben, áttéteket képezve, és ezáltal csökkentve a kezelésre adott választ és a betegségmentes túlélés lehetőségét. Ezért a gyógyszerkutatás egyik legfontosabb kihívása a kemoterápiás szerek toxicitásának csökkentése, valamint hatékonyabb és eredményesebb gyógyszerek kifejlesztése a kezelések, a gyógyulási idők és a betegek általános életminőségének javítása érdekében.

A természetes termékek a kémiai szerkezetek gazdag forrását jelentik a rákellenes kezelések fejlesztéséhez. Az onkológiai gyógyszerészet területén a kemoterápiában alkalmazott gyógyszerek 49%-a természetes forrásokból, például növényekből, mikroorganizmusokból és tengeri élőlényekből származik, vagy azok ihlették őket (Newman és Cragg, 2016). Ilyen például a vinka-alkaloidok és a taxánok (tubulin-kötő szerek), továbbá a podofillotoxinok, az antraciklinek és az etopozidok (topoizomeráz-gátlók) (Da Rocha és mtsai., 2001; Nobili és mtsai., 2009). Ezek a példák jól szemléltetik a természetes termékekben rejlő lehetőségeket a gyógyszerkutatásban.

Az AA-k az Annonaceae család által termelt másodlagos metabolitok (1. ábra). A hagyományos gyógyászatban az Annona nemzetség termését láz, fájdalom, reuma, hasmenés és ízületi gyulladás kezelésére, leveleit pedig cukorbetegség, fejfájás és álmatlanság kezelésére használják (Moghadamtousi et al., 2015a). Az Annona reticulate-t Afrikában diszenterikus és féreghajtás elleni gyógyszerként alkalmazzák, az A. squamosa-t pedig Indiában különböző állapotok, köztük rosszindulatú daganatok kezelésére használják (Savithramma et al., 2011). Továbbá az A. muricata Amerikában, Afrikában és Indiában népszerű gyógyhatású szer a rák kezelésére (Moghadamtousi et al., 2015a), míg Mexikóban az A. macroprophyllata, az A. muricata és az A. purpurea bőrdaganatok és gyomorrák kezelésére használatos (Alonso-Castro et al., 2011; Brindis et al., 2013). A mexikói gyógynövények etnofarmakológiai áttekintése szerint az Annona nemzetség a vastagbélrák kezelésére is felfedezhető (Jacobo-Herrera et al., 2016). Ezek a bizonyítékok arra utalnak, hogy az AA-k jelentős bioaktív potenciállal rendelkező molekulák.

Már több mint 500 AA-t írtak le; ezeket a vegyületeket hosszú alifás lánc jellemzi, α, β-telítetlen γ-laktongyűrűvel és 0-3 tetrahidrofurán (THF) gyűrűvel (Yuan et al., 2015), és citotoxikus aktivitást mutattak különböző humán rákos sejtvonalakkal szemben (pl. tüdő, emlő, vastagbél, vese, hasnyálmirigy, prosztata, máj és húgyhólyag) (áttekintés: Zeng et al, 1996; Chávez és Mata, 1998; Wang et al., 2002; Yuan et al., 2003; Mangal et al., 2016; Miao et al., 2016a; Miao et al., 2016b) mellett in vivo tumorellenes aktivitást (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b). A következőkben áttekintettük az AA-król szóló legfrissebb jelentéseket a gyógyszerkutatás-onkológia területén.

Anyagok és módszerek

A PubMed adatbázisban a következő kulcsszavak használatával végeztünk keresést: “acetogeninek és rák”, “acetogeninek daganatellenes aktivitása”, “acetogeninek citotoxicitása” és “acetogeninek hatásmechanizmusa”, egyéb kombinációk mellett. Áttekintettük az elmúlt 15 évben megjelent cikkeket, amelyek két kritérium alapján készültek: gyógyászati célú növények és a bioassay-vezérelt frakcionálási módszertan. Az itt közölt in vitro adatok kizárólag a tiszta vegyületek aktivitásán alapulnak, míg az in vivo vizsgálatoknál a növényi kivonatokat is figyelembe vettük az állatmodelleken végzett vizsgálatok hiánya miatt.

Eredmények és megbeszélés

In vitro vizsgálatok

A természetes termékek területén a bioaktív molekulák keresése általában a kivonatok bioassay-vezetett frakcionálásával történik, hogy megtaláljuk az aktivitásért felelős főmolekulát vagy molekulákat. Számos másodlagos anyagcseretermék azonban a rák több jellemzőjét is célba veheti. A gyógyszeripar általában olyan gyógyszerek iránt érdeklődik, amelyek egynél több molekuláris kölcsönhatást mutatnak, és különböző molekuláris célpontokat foglalnak magukban.

Az acetogeninek olyan molekulák, amelyek nagy potenciállal rendelkeznek a jövőbeli rákterápiában. Legkiemelkedőbb biológiai aktivitásuk a mitokondriális Komplex I gátlása bis-THF szerkezetüknek köszönhetően. Korábban ugyanis arról számoltak be, hogy a laktonrészt a THF-csoporttal összekötő alkilláncot viselő mono-THF AA-k a légzési láncban lévő Komplex I (azaz a NADH: ubikinon oxidoreduktáz) nem kompetitív gátlói, ami a foszforilatív oxidáció blokkolásához, majd az ATP-termelés csökkenéséhez vezet (Tormo et al., 1999; Chen et al., 2012). Ez a gátlás számos olyan útvonalat érint, amelyek sejthalált indukálhatnak, beleértve az apoptózist és az autofágiát, vagy más metabolikus hálózatokban a laktát-dehidrogenáz A enzim gátlójaként, antioxidánsként vagy a sejtciklus megállításával hatnak.

Mégis az A. muricata (Moghadamtousi et al, 2015a) és az A. squamosa L. (Chen et al., 2012a; Chen et al., 2012b; Chen et al., 2012c; Chen et al., 2016) citotoxikus aktivitásáról számoltak be számos emberi vagy más emlős rákos sejtvonallal szemben. Különösen az AA-k annoszvatin A (1) és B (2) mutatnak szelektivitást az MCF-7 és az A-549 sejtvonalakkal szemben (Chen et al., 2012c). Az 1. táblázat mutatja a legújabban felfedezett, citotoxikus aktivitást mutató AA-kat, valamint más, kevésbé új keletű vegyületeket, amelyek in vivo antineoplasztikus aktivitást mutatnak (2. táblázat).

Az apoptózis a sejthalál természetes stratégiája, amely elpusztítja a felesleges vagy sérült sejteket. A fő gének, amelyek ebben a folyamatban részt vesznek, a p53 és a bcl2 család; az előbbi tumorszuppresszor, míg az utóbbiak vagy proapoptotikus (többek között BAD, BAX és BAK) vagy antiapoptotikus (bcl2, és bcl-x) gének lehetnek (Okada és Mak, 2004). A p53 elsődleges funkciója a DNS-károsodott sejtek szaporodásának megakadályozása. Ezért a p53 inaktív, és a károsodott sejtek tovább növekednek és DNS-mutációkat replikálnak, ami olyan betegségekhez vezet, mint a rák (Igney és Krammer, 2002; Okada és Mak, 2004). Így az eddig végzett kutatások két fő témakörbe sorolhatók: apoptózis indukció vagy apoptózis rezisztencia mechanizmusok.

A jelenlegi apoptózist indukáló kemoterápiák súlyos másodlagos hatásokat okoznak a betegeknek. Ezért a kevésbé toxikus gyógyszerek keresése prioritást élvez, és a természetes termékek várhatóan segíteni fogják az apoptózist moduláló gyógyszerek kifejlesztését. Ebben az összefüggésben az AA-k felszabályozzák a kaszpáz 3 és 8 (apoptózis effektorok) aktivitását, miközben a survivin és a Bcl-2 expresszióját lefelé szabályozzák, ezáltal fokozva az apoptózist. Az AA annonacin (3) a kaszpáz 3 és Bax útvonalak aktiválásával elősegíti az apoptózist a rákos sejtekben (Yuan és mtsai., 2003), míg a squamocin a Bax és Bad proapoptotikus gének expresszióján keresztül indukálja az apoptózist, ami a PARP hasítását és a kaszpáz 3 fokozott aktivitását eredményezi a hólyag T24 rákos sejtekben (Yuan és mtsai., 2006). Ez ellentétben áll korábbi eredményekkel, ahol a squamocin nem indukált apoptózist emlőráksejtekben, de gátolta a proliferációt a sejtciklus G1 fázisban történő blokkolásával (Raynaud et al., 1999).

A. reticulata metanolos kivonata gátolja a kaszpáz 6 és 9 expresszióját vastagbél- és májráksejtekben (Mondal et al., 2007), míg az A. squamosa szerves és vizes kivonata lefelé szabályozza a Bcl-2 expresszióját MCF-7 emlőráksejtekben és K-562 leukémiasejtekben, ami apoptózist indukáló hatásukra utal (Pardhasaradhi et al., 2005). Ezenkívül az A. muricata levélkivonata indukálja a kaszpáz 3 és 9 expresszióját és gátolja a sejtproliferációt a foszfo-ERK és foszfo-AKT csökkentésével a MIA PaCa-2 sejtekben (Yiallouris és mtsai., 2018).

Az AA-k ciklusmegálláshoz is vezetnek, ami hatással van a tumorsejtek proliferációjára. Az AA-k szabályozzák a sejtciklust a G1/S átmenetben a ciklin D1 expressziójának gátlásával humán hepatocelluláris karcinóma sejtekben (Qian és mtsai., 2015). Ebben az összefüggésben az A. muricata kivonat koncentrációfüggő módon megállítja a sejtciklust a G1 fázisban, és csökkenti az S fázisban lévő sejtek számát azáltal, hogy csökkenti a ciklin D1, a sejtciklus fontos szabályozó fehérjéjének expresszióját (Torres és mtsai., 2012). Hasonló eredményt figyeltek meg a squamocin esetében is, amely a G1 fázisban tartóztatja le a sejteket a T24 hólyagráksejtekben (Yuan és mtsai., 2006). A sejtciklus jelentőségének ellenére kevés tanulmány foglalkozott azzal, hogy az AA-k hogyan befolyásolják ezt a mechanizmust.

Az aerob glikolízis, a tumorsejtek által oxigén hiányában az energia kinyerésére használt mechanizmus (Figueroa-González et al., 2016; García-Castillo et al., 2017) szintén az AA-k célpontja. Különböző fehérjéket és glikolitikus enzimeket szabályoz fel a HIF-1, a tumor aerob glikolízisében részt vevő fontos transzkripciós faktor a rákos sejtekben. Érdekes módon az A. muricata kivonat csökkentette a HIF-1α és az NF-κB expresszióját, valamint a glükóz transzporter GLUT1 és a HKII és LDHA enzimek szintjét hasnyálmirigyrák sejtekben (Torres és mtsai., 2012). Ezenkívül az A. muricata levélkivonata antiproliferatív hatást mutatott rákos sejtvonalakban és elősegítette a sejthalált az NKA és SERCA pumpák gátlása révén (Yiallouris et al., 2018).

Másrészt az MDR1 gén kódolja a sejtmembrán P glikoproteint, egy kulcsfontosságú transzporterfehérjét, amely a rákellenes gyógyszereket a sejtek belsejéből extrudálja, ezáltal korlátozva azok intracelluláris felhalmozódását és csökkentve toxicitásukat (Figueroa-González et al., 2012). A másodlagos metabolitok, például a flavonolok, ginzenozidok, polifenolok, alkaloidok és gyantaglikozidok érdekes eredményeket mutattak a P-gp modulálásában rákos sejtvonalakban (Phang és mtsai., 1993; Beck és mtsai., 1988; Silva és mtsai., 2001; Jodoin és mtsai., 2002; Zhou és mtsai., 2004; Figueroa-González és mtsai., 2012). Továbbá az AA-k képesek lefelé szabályozni az MDR1 és MRP1 gének expresszióját gyógyszerrezisztens humán hepatocelluláris karcinómában, valamint a topoizomeráz IIα és a glutation S-transzferázΠ expresszióját (Qian és mtsai., 2015).

A közelmúltban az autofágia mint a sejthalál mechanizmusa keltett érdeklődést. Az autofágia egy olyan katabolikus folyamat, amelyet az eukarióta sejtek stressz hatására, például a sejtek éhezése vagy kórokozók jelenléte esetén aktiválnak (He és Klionsky, 2009). E folyamat során a sejt a fehérjéket vagy a nem funkcionális organellákat egy többlépcsős, lizoszomális lebontással járó folyamat során újrahasznosítja, hogy végül helyreállítsa a sejt homeosztázisát (Kenific és Debnath, 2015). Mint ilyen, az autofágia-áramlás deregulációja rákhoz vezethet, mivel az újrahasznosított makromolekulák, nem funkcionális organellák és fehérjék a rákos sejtek számára magas metabolikus igényeket biztosítanak a sejtproliferációhoz (Kenific és Debnath, 2015; García-Castillo és mtsai., 2017). Ebben a forgatókönyvben az autofágia vonzó terápiás célponttá vált, és az AA-k képesek lehetnek e folyamat gátlására. Liu és munkatársai (2012) arról számoltak be, hogy az AA005 vegyület (egy acetogenin analóg) gátolta az ATP-termelést, aktiválta az AMPK-t, és blokkolta az mTOR Complex 1 útvonalat, hogy végül autofágiát indukáljon vastagbélrákos sejtekben, és megállítsa a sejtciklust a G1 fázisban. Ez a vegyület az AA-k mimikája, ahol a két THF-gyűrűt egy etilénglikol-éter egység helyettesíti. Az ilyen kémiai modalitás kiemelkedő biológiai aktivitást kölcsönöz, ami példa az AA-k plaszticitására, amelyet inspirációnak tekinthetünk új és erősebb, különböző farmakológiai célpontokkal rendelkező molekulák létrehozásához.

Az acetogeninek daganatellenes aktivitása állati modellekben

Az AA-k és az Annona-kivonatok rákellenes aktivitására vonatkozó adatok különösen ígéretesek, mivel ezek a vegyületek daganatellenes aktivitást mutattak állati modellekben. Az in vivo vizsgálatok kulcsfontosságú információkat szolgáltatnak a hatóanyag teljes szervezetben mutatott teljesítményéről, és lehetővé teszik nemcsak a daganatellenes hatásuk, hanem a különböző szervekre gyakorolt toxicitásuk értékelését is. Fontos, hogy az állatok olyan kísérleti alanyok, amelyek lehetővé teszik a klinikai nyomon követést, beleértve a klinikai kimenetel, a betegségmentes progresszió és túlélés, valamint a betegség kiújulásának értékelését.

A 12,15-cisz-szkvamosztatin-A (4) és bullatacin (5) AA-kban gazdag A. squamosa etil-acetát kivonata egerekben a pozitív kontrollhoz (ciklofoszfamid) képest 69,55%-os maximális gátlási aránnyal csökkentette a májsejtes daganatok tumor növekedését (Chen et al., 2012b). Azt feltételezték, hogy az egyik komponens cisz-konfigurációja lehet felelős a növényi készítmény citotoxikus hatásáért. Ezenkívül az A. squamosa-ból izolált bullatacin (5) 15 μg/kg dózisban hatékonyan, 65,8, illetve 63,4%-kal csökkentette a tumor növekedését S180 és HepS xenograftokat hordozó egerekben. Ezek az eredmények felülmúlják a taxol magasabb koncentrációjával (40 μg/kg) elért eredményeket. A bullatacin (5) egy szomszédos bis-THF-résszel és három hidroxi-csoporttal rendelkezik, amelyek valószínűleg a bioaktív szerkezetet alkotják (Chen et al., 2012a).

Az A. squamosa magolaj 53,54%-ban gátolta a tumor növekedését H22 sejteket hordozó egerekben (Chen et al., 2016) és csökkentette az IL-6, Jak és különböző foszforilált jelátvivők és a transzkripciós p-Stat3 útvonal aktivátorainak expresszióját. Arról is beszámoltak, hogy az AA-kban jelen lévő α, β-telítetlen γ-laktonrészek Michael-reakció akceptorok (Ji et al., 2012), amelyek gátolják a Stat3 aktiválódását, amely terápiás célpont, amely részt vesz a sejtproliferációban, apoptózisban, gyulladásban és angiogenezisben (Cafferkey és Chau, 2016). Az A. muricata kivonata lelassította a tumor növekedését hasnyálmirigy xenotranszplantátumokban (Yiallouris et al., 2018), csökkenti az áttétképződést a metalloproteináz-9 szintjének csökkentésével, és elősegíti a rákos sejtek elhalását a nekrózis révén (Torres és mtsai., 2012). Prosztata xenograftban a flavonoidokkal dúsított A. muricata kivonat javította a biohasznosulást és alacsonyabb toxicitást mutatott, mint az AA-kkal dúsított kivonat (Yang és mtsai., 2015).

Az A. diversifolia gyógynövényből izolálták a laherradurint (6) és a cherimolin-2-t (7), és in vivo tesztelték a méhnyak- és vastagbélráksejtek ellen (Schlie-Guzmán és mtsai., 2009). Mindkét AA a doxorubicinhez hasonló értékekkel csökkentette a HeLa-tumorok méretét; mindkét vegyület antiproliferatív aktivitást mutatott in vitro ugyanezen rákos sejtvonallal szemben is. Ezek az eredmények összhangban vannak más jelentésekkel, ahol a legaktívabb molekulának a laherradurin (6) bizonyult, amely szomszédos bisz-THF-részekkel és β-hidroxi γ-metil γ-lakton szerkezettel rendelkezik, míg a nem szomszédos bisz-THF-részt és γ-lakton egységet tartalmazó cherimolin-2 (7) csökkent tumorellenes aktivitást mutat. A 2. táblázat a különböző AA-k tumorellenes aktivitását mutatja be állatmodellekben.

Toxicitási vizsgálatok

Az állatokkal végzett kísérleteknek akut orális toxicitási protokollokat kell tartalmazniuk a vegyi anyagok tesztelésére és a toxicitás jeleinek megfigyelésére; ezek minimalizálják a szükséges állatok számát, biztosítják a kísérletek során a megfelelő dózis beadását és a szenvedés elkerülését (OECD, 2008). A mai napig azonban kevés információ áll rendelkezésre az AA-k vagy az Annona-kivonatok toxicitásáról. Például az A. muricata etanolos kivonatának LD50 értéke egerekben 1,67 g/kg volt Sousa et al. (2010) szerint. Arthur és munkatársai (2011) a vizes kivonat LD50 értékét (<5 g/kg) közölték, rögzítve, hogy a magasabb dózis károsíthatja a veséket. Azt is megfigyelték, hogy az A. squamosa magkivonata májkárosodást okozhat (Miao et al., 2016b), a flavonoidokkal dúsított A. muricata kivonat pedig csökkent toxicitást mutatott prosztata xenograftban (Yang et al., 2015). Az A. diversifoliából izolált Cherimolin-2 5 mg/kg/nap feletti dózisban toxikus hatást és pusztulást mutatott SW480 xenograftokban (Schlie-Guzmán és mtsai., 2009).

Amint azt korábban kifejtettük, az AA-k gátolhatják a légzési lánc 1-es komplexét a mitokondriumokban történő elektronlánc-transzporton keresztül. Az AA-k csatlakoznak és blokkolják a NADH enzimet, amely általában túlreprezentált a rákos sejtekben, gátolva az ATP-termelést, ami végül a sejtek halálához vezet. Feltehetően ez a mechanizmus arra utal, hogy az AA-k “ártalmatlanok” a normál sejtekre; mégis, további vizsgálatokat kell végezni e molekulák szelektivitásának biztosítása érdekében.

Következtetés

A kemoterápia nem specifikus a rákos sejtekre; számos nemkívánatos mellékhatást okoz, például a normál szövetek és szervek károsodását. A hagyományos kemoterápia legfontosabb aspektusa azonban az, hogy az esetek jelentős részében a rákos sejtek rezisztencia mechanizmusokat fejlesztenek ki, amelyek lehetővé teszik a tumor progresszióját és az áttétképzést.

A természetben nem új keletű az új gyógyszerek keresése. Jelenleg is számos természetes anyag származékát használják különböző betegségek kezelésére. Például a hagyományos tudás által felfedezett taxol (paclitaxel) a legjövedelmezőbb rákgyógyszernek számít a piacon. Érdekes módon a paclitaxel egy antimitotikus gyógyszer, amely sejtkultúrákban gátolja a sejtproliferációt, de a tumorokban dokumentáltan többpólusú osztódást idéz elő, ami jól mutatja, hogy egy molekulának különböző hatásmechanizmusai lehetnek az in vitro vagy a beteg körülményeitől függően. Ez az alkaloid 30 éves múltra tekint vissza, és jól szemlélteti a természetes termékekkel való munka fő akadályait, korlátozott biológiai elérhetőségüket és előállítási költségeiket, valamint a rákos sejteket pusztító hihetetlen hatékonyságukat.

Az acetogeninek sokoldalú rákellenes molekulák, amelyek különböző mechanizmusok révén tumorsejtpusztulást okoznak. Módosíthatják a kemoterápiás gyógyszerek ráksejtekből való kizárását, és erős apoptózisinduktorok. Bioaktív rugalmasságukat tükrözi, hogy képesek szabályozni a sejtciklust a sejtek G1 fázisban való megállításával, különböző fehérjék gátlásával elősegítik az apoptózist, sőt autofágiát is indukálnak. Ezenkívül kiemelkednek metabolikus kölcsönhatásaik, különösen a HIF1 és a STAT3 transzkripciós faktorokhoz kapcsolódóan, valamint az energiafogyasztás, az angiogenezis, a gyulladás és az áttétképződés visszahatásai. Az AA-k in vivo tumorellenes aktivitása ígéretes (a bullatacin, a laherradurin és a cherimolin-2 példák). A preklinikai adatok azonban nem elegendőek az AA-k farmakodinamikájának és kinetikájának megfelelő megértéséhez, és több akut toxicitási és oldhatósági vizsgálatra van szükség a biztonságosság és az embereken végzett klinikai kísérletek lehetőségének biztosításához. Ezenkívül különböző ligandumok (pl. antitestek, vitaminok és peptidek) beépítése vagy tumorspecifikus származékok előállítása javíthatja az AA-aktivitást, és alkalmasabb gyógyszereket eredményezhet.

A növényi kivonatok kémiailag összetettek, és gyógyhatásuk gyakran a vegyületek közötti kölcsönhatásoktól és a kivonaton belüli arányuktól függ. Még sok felfedezni való van az AA-k rákban kifejtett hatásait illetően. Ez a terület lehetőséget nyújt arra, hogy új molekulákat találjunk ennek az összetett betegségnek a kezelésére. A kivonatok standardizálása ezért a gyógynövény-kiegészítők használatának lehetséges alternatívája, különösen azoknál a növényeknél, ahol a farmakológiai aktivitás egynél több vegyület kombinációján alapul. Ez a mini-áttekintés felsorol néhány korábban vizsgált AA-t, amelyek daganatellenes aktivitást mutatnak, és jövőjük lehet a klinikai rákkutatásban.

A szerzők hozzájárulása

NJ-H hozzájárult a cikk koncepciójához, megírásához és megvitatásához; CP-P jelentősen hozzájárult a kézirat megvitatásához és átdolgozásához; VC-T elkészítette az összes ábrát és táblázatot; MM-V és AG-E hozzájárult a cikk kémiai részéhez; AZ-D jelentősen hozzájárult a cikk molekuláris biológiai megvitatásához. Minden szerző megvitatta, átdolgozta és jóváhagyta a kézirat végleges, közzétételre szánt változatát.

Finanszírozás

Ezt a munkát a mexikói Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) támogatta (285884-es számú támogatás). VC-T-t a CONACYT támogatta (PhD-ösztöndíj száma 267787).

Érdekütközésre vonatkozó nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetők.

Köszönet

NJ-H köszönetet mond a CONACYT-nek a projekt finanszírozásáért.