A glicerinből történő 1,3-propándiol vagy 3-HP előállítása során a tejsav a fő melléktermék, amely jelentősen csökkenti a termékhozamot. Ezért kísérleteket tettek a laktáttermelés csökkentésére a laktát-dehidrogenázt kódoló gén deléciójával (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Mivel az 1,3-propándiolt és a 3-HP-t képző két reakció verseng a közös szubsztrátért, a 3-hidroxialdehidért (3-HPA), a propándiol-oxidoreduktáz deléciója a 3-HP-termelésnek kedvez (Ashok et al. 2011). Ezért ebben a vizsgálatban az ldhA és a dhaT géneket kiütöttük a 3-HP-termelés fokozása érdekében.
A ldhA hiányának hatása a 3-HP-termelésre
A JJQ01 ldhA hiányos törzset konstruáltuk, és az ldhA kiütését megerősítettük, amint az S2A ábrán látható. A rekombináns Kp4(pUC18-kan-aldH) és JJQ01(pUC18-kan-aldH) törzseket konstruáltuk, és 5 literes bioreaktorban feed-batch fermentációkat végeztünk. A sejtnövekedés, a glicerinfogyasztás és a metabolitok termelésének profiljait a 2a, b. ábra mutatja. A Kp4(pUC18-kan-aldH) 38 óra alatt 18,3 g/l 3-HP-t termelt 0,21 mol/mol hozammal, míg a tejsav 32,2 g/l-t ért el, magasabb, 0,34 mol/mol hozammal. Ezenkívül 17,6 g/L 2,3-butándiol, 6,1 g/L 1,3-propándiol és 10,7 g/L ecetsav keletkezett. A laktát képződése nemcsak a költségeket növeli, hanem a laktát izomerjének számító 3-HP visszanyerésének nehézségét is. Ezenkívül a laktát a 3-HP és az 1,3-propándiol bioszintézisének egyik fő inhibitora (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). Az ldhA hiánya hatékonyan megszüntette a laktátképződést, és a 3-HP-termelés elérte a 48,3 g/l-t 0,28 mol/mol hozammal, amint azt a 2b. ábra mutatja. A 3-HP koncentrációja és hozama ebben az ldhA hiányos törzsben 1,64-szeresére, illetve 33,3%-kal nőtt a Kp4(pUC18-kan-aldH) törzshez képest. A kis mennyiségű etanolképződéstől eltekintve (kb. 4 g/L) a piruvát és a formiát felhalmozódását az ldhA mutáns törzsben nem észleltük, ami a vad típusú törzs használata esetén szinte egyáltalán nem volt megfigyelhető.
Az eredmények egyértelműen jelezték, hogy a tejsavtermelés blokkolása nagymértékben átirányította a szénáramlást a 3-HP-termelésre. A glicerin asszimiláció a DhaB-n keresztül jelentősen javult, közel 0,4 mol/mol glicerin irányult a DhaB-n keresztül a 3-HPA-hoz, ami összhangban volt más vizsgálatokkal (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). A laktát csökkentése csökkenthette a sejtek toxicitását, kedvezhetett a sejtnövekedésnek és a 3-HP termelékenységének. A laktát csökkentése azonban fokozta a 2,3-butándiol és az 1,3-propándiol képződését is, amely elérte a 21,9 g/l-t 0,13 mol/mol, illetve a 18,5 g/l-t 0,12 mol/mol hozammal. Az ldhA deléció miatt a megnövekedett 3-HP felhalmozódásból származó NADH felesleg elősegítheti a 2,3-butándiol és 1,3-propándiol termelését a laktát helyett a NAD+ regenerálása és a redox egyensúly fenntartása érdekében. Valójában az etanol képződése is támogatta a NAD+ regenerációt, ami nagyobb fluxust eredményezett a piruvátból etanolba, mint a piruvátba.
A dhaT hiányának hatása a 3-HP termelésre
A ldhA deléciója drámaian megnövelte a 3-HP termelést, ugyanakkor az 1,3-propándiol termelés is 18,5 g/l-re nőtt. Ko és munkatársai (2017) arról számoltak be, hogy 43 g/L 3-HP-t és 21 g/L 1,3-propándiolt nyertek az acetát és más melléktermékek redukciójával. Bár az 1,3-propándiol képződése a kofaktor regenerálásával előnyös a glicerin hasznosítására, a glicerin szénáramának jelentős részét teszi ki. Mivel az 1,3-propándiol és a 3-HP verseng ugyanazon prekurzorért, a 3-HPA-ért, az 1,3-propándiolra történő fluxus korlátozására az ldhA és dhaT kettős-knockout törzset (látható az 1. kiegészítő fájlban: S2B ábra) JJQ02(pUC18-kan-aldH) konstruáltuk. Az 5 literes reaktorban végzett feed-batch fermentáció eredményeit a 2c. ábra mutatja. Váratlanul az egyidejű ldhA és dhaT kiütés csak 44,5 g/L 3-HP-t eredményezett, annak ellenére, hogy a hozam 0,32 mol/mol glicerinre nőtt. A dhaT deléciója az 1,3-propándiol titer és hozam 9,9 g/L-re, illetve 0,07 mol/molra csökkentését eredményezte. Az YqhD és más oxidoreduktázok által katalizált reakcióban azonban továbbra is keletkezett 1,3-propándiol (Ashok és mtsai. 2013). Továbbá, a JJQ01(pUC18-kan-aldH)-hoz képest a 2,3-butándiol-termelés 21,9 g/L-ről 23,4 g/L-re nőtt kissé, ami azt jelzi, hogy a 2,3-butándiol-útvonal felé irányuló fluxus megnőtt az ALDH katalizált reakcióból származó NADH-felesleg elfogyasztása érdekében. Az 1,3-propándiol szintézis kulcsszerepet játszik a K. pneumoniae redox egyensúlyának szabályozásában. Az oxidációs útvonalon belül egy molekula acetát képződése glicerinből három molekula NADH-t termel, ugyanakkor egy molekula ATP képződik. Következésképpen mind az ldhA, mind a dhaT deléciója jelentősen csökkentette a NAD+ regenerációs képességét, és több NADH oxidálódott a 2,3-butándiol képződésén keresztül, ami a 2,3-butándiol növekedését eredményezte. A levegőztetési sebesség csökkentése (az oxigénellátás korlátozása) fokozhatta az acetáttermelést, hogy több ATP-t biztosítson, de ezzel egyidejűleg több NADH képződött, ami a 2,3-butándiol termelés további növekedését eredményezte. Úgy tűnt azonban, hogy a regenerált NAD+ kevesebb volt, mint a DhaT által katalizált reakcióban képződött, ami alacsonyabb 3-HP-termeléshez vezetett. Ezért a megfelelő mennyiségű oxigén biztosítása a NAD+ előállításához a DhaB aktivitásának és a glicerin disszimilációjának befolyásolása nélkül kritikus a 3-HP-termelés szempontjából a mikro-aerob fermentációban.
Ebben a vizsgálatban nem sikerült javítani a 3-HP-t a dhaT gén törlésével. A glicerin-diszszimilációt a glicerin-dehidrogenáz DhaD, a glicerin-kináz GlpK, a glicerin-dehidratáz DhaB és az 1,3-propándiol oxidoreduktázok 1,3-PDOR-ok szabályozzák. A glicerin elágazási pont merevsége azt jelenti, hogy a 3-HP-termelés javítása a glicerin fluxusmegosztásban részt vevő gének deléciójával nehézkes. Ashok és munkatársai (2011) meghatározták a DhaD, DhaB, ALDH és 1,3-PDOR-ok eredendő aktivitását a dhaT gén deléciója után. Azt találták, hogy a DhaD aktivitása kissé javult, az ALDH aktivitása kissé csökkent, a DhaB aktivitása pedig jelentősen csökkent. Zhang és munkatársai (2008) szintén elemezték a glicerin-diszszimilációs útvonal elágazási pontjainak robusztusságát. Kimutatták, hogy a szénáram megoszlása a reduktív és az oxidatív ág között robusztus volt a környezeti körülményekkel szemben.
A levegőztetés hatása a 3-HP termelésre
A korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy a mikro-aerob körülmények kedvezőek a 3-HP termeléshez. Az anaerob folyamathoz képest a mikro-aerob fermentációban a 3-HP termelés jelentősen fokozódott az aldehid-dehidrogenáz magasabb expressziós szintjének köszönhetően, ugyanakkor az 1,3-propándiol termelés csökkent (Huang et al. 2013). Wang és munkatársai (2011) arról számoltak be, hogy a glicerin-dehidratáz specifikus aktivitása K. pneumoniae-ban 0,04 vvm-es levegőztetési sebesség mellett 59%-kal magasabb volt, mint levegőellátás hiányában. Azonban arról is beszámoltak, hogy a glicerin-dehidratáz gyorsan inaktiválható oxigén hatására (Toraya 2000; Ruch és Lin 1975), és jelentősen befolyásolta a 3-HP termelést (Xu és mtsai. 2009a; Huang és mtsai. 2013; Niu és mtsai. 2017). Emellett a B12 koenzim, a DhaB kofaktora, a legtöbb természetes 3-HPA-termelőben, például a K. pneumoniae-ban, nem szintetizálódik kellőképpen magas levegőztetési körülmények között. Huang és munkatársai (2013) és Ko és munkatársai (2017) szintén kimutatták, hogy a magas aerob körülmények nem előnyösek a 3-HP-termelés szempontjából. Ezért előzetes feed-batch kísérleteket végeztünk különböző levegőztetési körülmények között, és azt is megállapítottuk, hogy a magas levegőztetési sebesség fenntartása kedvezőtlen a 3-HP-termelés szempontjából, miután a sejtnövekedés leállt (az adatok nem láthatóak). A JJQ02(pUC18-kan-aldH) táplált tételes tenyésztése során a kezdeti sebesség felének megfelelő levegőztetési sebességet alkalmaztunk, amikor az OD650 a maximális értékre zárult. A növekedés, a glicerin és a metabolitok profiljait a 3. ábra mutatja, a fekete nyíl pedig a levegőztetési sebesség csökkentésének (0,5 vvm) időpontját jelezte.
A 3-HP végső titere elérte a 61. pontot.9 g/l-t 0,58 mol/mol hozammal az 5 literes reaktorban 38 óra alatt. A JJQ02(pUC18-kan-aldH) 3-HP-koncentrációja és hozama 3,3- és 2,76-szorosa volt a Kp4 (pUC18-kan-aldH), illetve 1,28- és 2,07-szerese a JJQ01(pUC18-kan-aldH) által elért értékeknek. Az eredmények azt mutatták, hogy mind az 1,3-propándiol, mind a 2,3-butándiol termelése 20 órakor leállt. A 3-HP titer azonban tovább nőtt, bár a termelési sebesség ettől az időponttól kezdve csökkent. A mikro-aerob fermentáció későbbi szakaszában, bár kevés NADH regenerálódott az 1,3-propándiol és a 2,3-butándiol képződésével, némi NADH még mindig regenerálódhatott az elektrontranszportláncon keresztül, mivel a NAD+ regenerálódásának leghatékonyabb módja az elektrontranszportláncon keresztül, oxigén jelenlétében történik (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), ami a 3-HP növekedését eredményezte az 1,3-propándiol és a 2,3-butándiol nyilvánvaló növekedése nélkül.
300-L méretnövelő fermentáció
A JJQ02(pUC18-kan-aldH) törzs nagyobb bioreaktorban történő 3-HP-termelésének megvalósíthatóságát vizsgálandó, az 5-L-es fermentorban megállapított fermentációs feltételeket követve egy 300-L-es bioreaktorban végeztük el a feed-batch fermentációt. Kétlépcsős levegőztetési stratégiát alkalmaztunk; a levegőztetési sebességet a 4. ábrán látható fekete nyíl időpillanatban a felére csökkentettük. 3-HP esetében 54,5 g/l-t értünk el 0,43 mol/mol hozammal, az 1,3-propándiol esetében pedig 12,2 g/l és 0,11 mol/mol, 21,3 g/l és 0,11 mol/mol koncentrációt és hozamot értünk el.17 mol/mol a 2,3-butándiol esetében, valamint 9,3 g/L és 0,11 mol/mol az acetát esetében 51 óra alatt (4. ábra).
Az 5 literes reaktorban kapott eredményekkel összehasonlítva a 300 literes reaktorban a 2,3-butándiol titere és moláris hozama egyértelműen megnőtt, ami hasonló volt az 5 literes reaktorban azonos törzzsel, állandó 1 vvm-es levegőztetési sebesség mellett kapott eredményekhez. Ez arra utalt, hogy az oxigénátadás a 300-L reaktorban valamivel nagyobb lehet, mint az 5-L reaktorban csökkentett levegőztetési sebesség mellett, mivel egyes kutatások szerint a 2,3-butándiol előállítása megfelelő levegőztetési sebességet igényel (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). A 300 literes reaktorban a levegőztetési körülmények között a 2,3-butándiol-képződéssel kapcsolatos enzimek kifejeződése és a NADH-pool vagy a NADH/NADH+ arány elősegítette a 2,3-butándiol termelését, a DhaB és az AldH kifejeződését pedig kissé befolyásolhatta.
A redox egyensúlyra való tekintettel az ldhA dhaT kettős mutáns törzsben az ALDH által katalizált reakcióban képződött NADH részben a 2,3-butándiol és más redukált metabolitok, például etanol és szukcinát képződésével, részben pedig az elektrontranszportlánc segítségével regenerálódott (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Ezért a mikrolevegőztetéses fermentációban a levegőztetési sebesség jelentősen befolyásolta a végtermékeket. A 300 literes reaktorban történő fermentáció során, bár a levegőztetési sebességet a kiindulási érték felére csökkentettük, az oxigénátadási helyzet az eltérő oxigénátadási jellemzők miatt még mindig nagymértékben eltérhet az 5 literes reaktoréhoz képest, ami a biotechnológiai folyamatok méretnövelésének hagyományos témája volt. A különböző reaktorokban a termékek eloszlásában mutatkozó különbségek az oxigénellátás pontos szabályozásának fontosságára utaltak, míg a levegőztetési sebesség egyszerű csökkentése túl durvának tűnt. Bár a 3-HP-titer és a hozam némileg eltért az 5 literes reaktorban mért értékektől, a méretnövelés mégis sikeres volt. Mivel a 300 literes reaktorban az oxigénátadás teljesítménye különbözött az 5 literes reaktorétól, várható volt, hogy a 300 literes reaktorban a levegőztetési sebesség további pontos szabályozása növelheti a 3-HP szintet.