A hAASS-SDH fehérje expressziója, tisztítása és vizsgálati eljárásai
Vektor: pFB-LIC-Bse
Cellvonal: DH10Bac
Címkék és adalékok: N-terminális, TEV proteázzal hasítható hexahisztidin tag
Fehérje szekvencia felépítése:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(az aláhúzott szekvencia vektor kódolt His-taget és TEV proteáz hasítóhelyet*)
A leszedett sejteket lízispufferben (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% glicerin, 20 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL per 1 mL proteáz inhibitor koktél EDTA-mentes).
A sejtpelletet kb. 200 mL lízispufferben oldottuk fel és homogenizálással törtük meg 2 átmenettel 12 000 psi nyomáson. A sejttörmeléket 35000 x g-n, 1 óra alatt pelletáltuk, a felülúszót pedig gravitációs áramlású Ni-NTA oszlopon (5 ml) történő tisztításhoz használtuk.
A felhasznált puffereket az alábbiakban részletezzük;
Megkötő puffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glicerin, 20 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Mosópuffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glicerin, 40 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Elúciós puffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glicerin, 250 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
A tisztított sejtkivonatot 5 ml lízispufferrel elő-equilibrált Ni-NTA gyantához adtuk, majd üvegoszlopon vezettük át. Ezután az oszlopot kötőpufferrel (2 x 50 ml) és mosópufferrel (2 x 50 ml) mostuk. A fehérjét elúciós pufferrel eluáltuk 5 x 5 mL frakciókban. Az 1. oszlopból eluált frakciókat összevontuk és egy 30 kDa MWCO spin koncentrátorral 5 mL-re koncentráltuk, majd 1,0 mL/perc sebességgel egy S200 16/60 oszlopba (előzetesen GF pufferben (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% glicerin) kiegyenlített) injektáltuk. Az 1,5 mL frakciókat gyűjtöttük. Az eluált fehérjét egy éjszakán át 4 °C-on TEV proteázzal (1/20 (w/w)) hasítottuk. Másnap a fehérjemintát 0,5 ml-es Ni-szefaróz oszlopra töltöttük, amelyet GF pufferrel előegyengetettünk, hogy eltávolítsuk a nem tisztított fehérjét. Az egyesített fehérjefrakciókat 30 kDa mwco koncentrátorral 13 mg/ml-re koncentráltuk.
Aktivitásvizsgálat és szűrés
A hAASS SDH-aktivitását a NAD+ NADH-ra történő redukciójának követésével mértük, kihasználva, hogy a NADH redukált formája 340 nm-es fénnyel gerjesztve fluoreszkál. A vizsgálatot 384 lyukú formátumba adoptáltuk, a detektálást a PheraStar fluoreszcens olvasóval (BMG Labtech) végeztük (gerjesztés/emisszió = 340/480 nm). Ez az assay 150 nM fehérjekoncentrációig lineáris választ adott. Egy tipikus reakció 100 nM tisztított enzim, 0,2 mM NAD+, 1,3 mM szacharopin. A reakciópuffer 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% CHAPS. A vegyületkönyvtárakat (LOPAC (Sigma) és NIH Clinical Collections I&II) házon belül, 20 μM vegyületkoncentrációban szűrtük.
Differenciális pásztázó fluorimetria
DSF-et végeztünk 96 lyukú lemezben egy Mx3005p RT-PCR gép (Stratagene) segítségével, 492 és 610 nm-es gerjesztési és emissziós szűrőkkel. Minden egyes mélyedés 2 µL fehérjét tartalmazott 2 µM DSF pufferben (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGE-t 1000-szeresére hígítva DSF pufferben a gyártó készletéből (Invitrogen), és (ha alkalmazható) 2 µL ligandumot különböző koncentrációban. A fluoreszcencia intenzitásokat 25 °C és 96 °C között mértük 3 °C/perc rámpa sebességgel.
Kristályosítás
Apo kristályokat úgy készítettünk, hogy 50 nL hAASS-SDH fehérjét (80 mg/ml) 100 nL 20% PEG3350-et, 0,1M Tris pH 7,5-t és 0,2-0,33 M nátrium-malonátot tartalmazó rezervoár oldattal kevertünk. A NAD+-hoz kötött kristályokat 100 nL hAASS-SDH (18 mg/ml, NAD+ moláris feleslegben) és 50 nL 25% PEG3350-et, 0,2M NaCl-t és 0,1M tris pH 8,5-t tartalmazó tartályoldat keverésével állítottuk elő. A kristályokat 9%-os butándiolban krio-védtük, mielőtt folyékony nitrogénben lefagyasztottuk volna. A fragmentumszűrési kampányhoz a kristályokat a 8% butándiollal kiegészített kristályosítási oldatban lévő vegyületekkel (10/50/500 mM) 5-30 percig áztattuk, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk.
Szerkezetmeghatározási eljárások
hAASS-SDH apo és NAD+-kötésű kristályok különböző tércsoportokba tartoznak (P43212 vs P212121). A hAASS-SDH szerkezetét molekuláris helyettesítéssel oldottuk meg a PHASER programmal, az S.cerevisiae gombából származó szacharopin reduktáz (PDB kód: 2AXQ) mint keresési modell segítségével (38%-os szekvencia azonosság). Az aszimmetrikus egységben (a.u.) két molekulát találtunk. A kezdeti modellt a phenix.autobuild segítségével építettük újra. Az aktív centrumban lévő kötött NAD+ molekulát differencia Fourier módszerrel azonosítottuk, és manuálisan helyeztük el az elektronsűrűségben a Coot segítségével. A modell befejezéséhez a phenix.refine iteratív ciklusait végeztük el, beleértve a TLS finomítást, majd a hiányzó maradékok kézi modellépítését a Coot segítségével. Nem alkalmaztunk NCS korlátozást a III. domén (resz 278-376) konformációs különbségei miatt a két példányban a.u. Az oldószeratomok elhelyezése a phenix.refine segítségével történt a finomítás utolsó négy fordulója során. A fragmentumszűrési kampányhoz a ligandumokat a DIMPLE (8) (https://github.com/ccp4/dimple) segítségével azonosítottuk a különbségsűrűség-térképek segítségével. Az alacsony foglaltságú gyengébb kötőanyagokat a PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/) segítségével értékeltük, amely statisztikai modelleken alapul, hogy megtaláljuk az adott adatkészletben jelen lévő ligandum sűrűségét, amely az adatkészletek többségében nincs jelen. Az összes adatkészlet koordinátái és szerkezeti faktorai az RCSB Protein Data Bankban vannak letétbe helyezve. Az adatgyűjtési és finomítási statisztikák elérhetők a PDB oldalain.
Kereskedelmi forgalomban kapható reagensek
CRISPR/Cas9 knockout plazmidok
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157