Két aminosavmaradék határozza meg a TRPV3 és TRPV4 ioncsatornák 2-APB érzékenységét

Eredmények

A 2-APB-reakciót specifikusan befolyásoló mutációk azonosítása.

Egerek TRPV3 mutáns könyvtárát vizsgáltuk, amely ≈14.000 cDNS-konstrukcióból áll, és klónonként átlagosan 2,5 mutációt tartalmaz, amelyeket hibás PCR segítségével állítottunk elő. A mutáns konstrukciókat humán embrionális vesesejtekbe (HEK293) transzfektáltuk, és a hő (42 °C), 25 μM 2-APB és 1,75 mM kámfor által kiváltott kalciumválaszokat fluoreszcens képalkotó lemezolvasóban (FLIPR) követtük nyomon. Nemrégiben ismertettük a TRPV3 hőaktiválásához specifikusan szükséges maradékok azonosítását (20). Itt a 2-APB és a kámfor adathalmazára összpontosítottunk, hogy azonosítsuk a kémiai válaszokhoz specifikusan szükséges maradékokat.

Specifikusan olyan klónokat választottunk ki, amelyek normális választ mutattak az egyik vegyszerre, de jelentősen csökkent aktivációt a másikra (a kiválasztási kritériumokat lásd a Módszereknél). A pozitív klónokat kiválasztottuk, újranövesztettük, és az egyes ingerekkel szemben teljes dózis-válasz görbéket mértünk, és kiszámítottuk az EC50 értékeket (lásd Módszerek). Hét mutáns klónról megerősítették, hogy specifikusan 2-APB-hiányos, és szekvenálták őket. Figyelemre méltó, hogy mind a 7 klón 2 maradékból 1 mutációt tartalmazott. Az első, a 426-os hisztidin (H) a citoplazmatikus N-terminális régióban, az ankyrin és a transzmembrán domének között található. A szűrés során a H426 4 különböző szubsztitúcióját azonosítottuk (1. táblázat). A második, az arginin (R) 696 a C-terminális citoplazmatikus TRP dobozban (IWRLQR), a TRP csatornák konzervált doménjében van jelen (2, 3). A 3 mutáció ennél a maradéknál ugyanazzal a szorosan kapcsolódó argininből lizinné történő szubsztitúcióval rendelkezik. Mind a 7 mutáció súlyos hiányosságokat okozott a 2-APB-válaszokban, anélkül, hogy befolyásolta volna a kámforválaszokat (1. táblázat). Bár néhány kámforhiányos klónt is azonosítottunk, ezek viszonylag finomabb mutációk voltak, amelyek a kámfor EC50-értékét ≈2-szeresére vagy annál kisebb mértékben eltolták (az adatok nem láthatóak). Ezért a vizsgálatot a specifikusan >10-szeres 2-APB-hiányt okozó 2 maradékra összpontosítottuk.

A TRPV3-H426 és TRPV3-R696 csatornák kezdeti elektrofiziológiai jellemzése.

AFLIPR az ioncsatorna aktivitás mérésének indirekt módja. FLIPR eredményeink megerősítésére patch clamp technikát alkalmaztunk, és a vad típusú egér TRPV3, TRPV3-H426N és TRPV3-R696K egészsejtes áramlásait mértük, amikor 2-APB-t (1 μM-tól 3 mM-ig) vagy kámfort (0,3-tól 20 mM-ig) egyenként fürdőben alkalmaztunk alacsony koncentrációtól a magas koncentrációig (1. ábra és S1 ábra). A 2-APB koncentrációfüggő módon aktiválta az áramokat a vad típusú TRPV3-mal transzfektált HEK293 sejtekben 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) és 36,8 ± 3 átlagos EC50 értékekkel.6 μM (nHill = 3,3) értékeket értek el +100 és -100 mV-on (1A ábra; S1A ábra); a 2-APB 100 μM-ig nem indukált mérhető áramokat a TRPV3-H426N transzfektált HEK293 sejtekben. A vad típusú TRPV3 számára telítődő 2-APB koncentrációk (0,3-3 mM) azonban koncentrációfüggő módon képesek voltak áramokat aktiválni ebben a mutánsban (1A ábra; S1A ábra). Következésképpen a TRPV3-H426N a 2-APB-függő aktiváció >10-szeres EC50 eltolódását mutatta, és a válasz soha nem érte el a telítettséget. Párhuzamos kísérletekben a vad típusú TRPV3-mal transzfektált HEK293 sejtekben a kámfor szintén koncentrációfüggő módon aktiválta az áramokat, 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) és 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) EC50 értékekkel +100 és -100 mV-on. Fontos, hogy a TRPV3-H426N transzfektált HEK293 sejtekben vad típusú kámforra adott válaszokat figyeltünk meg, ami megerősíti, hogy a kámfor aktivációja nem változik ebben a mutánsban (1A ábra; S1B ábra).

A teljes sejtes patch-clamp kísérletekben a 2-APB minimális TRPV3-R696K aktivációt is kiváltott. +100 mV-on a 2-APB ≈3 μM-nél kezdte aktiválni az ezt a mutáns csatornát expresszáló HEK293 sejteket, és 30 μM-nél érte el a telítettséget, az EC50 10,0 ± 1,3 μM volt (nHill = 2,1). A 2-APB magasabb koncentrációi (>30 μM) deszenzitizáló áramot idéztek elő, a 2-APB kimosása után “off-reakcióval”, amely jelenséget alább részletesen ismertetjük. Azonban -100 mV-on a 2-APB még 1 mM-nál sem tudta aktiválni az R696K mutáns csatornákat (1B ábra; S1A ábra). A maximális 2-APB válasz 1 mM-nál -100 mV-on -2,3 ± 1,4 pA/pF volt (n = 6), ami jelentősen kisebb (>10-szeres), mint a vad típusú TRPV3 csatornák esetében (-482,1 ± 69,2 pA/pF 300 μM-nál, n = 17), ami arra utal, hogy a TRPV3-R696K mutánsban csökkent a 2-APB által kiváltott maximális csatorna válasz. A kámfor azonban hasonló válaszokat aktivált a TRPV3- és TRPV3-R696K-transzfektált HEK293 sejtekben (1B ábra; S1B ábra). Ezért a kezdeti elektrofiziológiai adatok megerősítették a szűrési eredményeinket, miszerint a TRPV3-H426N és TRPV3-R696K mutánsok hiányosak a 2-APB-rezisztenciában, anélkül, hogy befolyásolnák a csatorna általános működését, amit a kámforra való válaszadási képességükkel teszteltünk.

A következő kérdésünk az volt, hogy a H426 és az R696 milyen oldallánc-tulajdonságai kulcsfontosságúak a TRPV3 2-APB általi aktiválásához. Egyenként mutáltuk a 426-os és a 696-os pozíciókat minden más aminosavra, és megmértük a FLIPR dózis-válasz görbéket mind a 2-APB, mind a kámfor esetében. Érdekes módon az összes H426 mutáns csökkent 2-APB-választ mutatott, az EC50-értékek erős (>10-szeres) növekedésével (S1 táblázat). A mutánsok többsége normális kámforválaszt mutatott, kivéve a spiráltörő prolin-szubsztitúciót, amely ≈2-szeres kámfor EC50-növekedést mutatott. Az adatok összhangban vannak az elsődleges szűrésünk eredményével, amely 4 különböző szubsztitúciót azonosított, amelyek 2-APB-hiányt eredményeztek ebben a pozícióban. Az F, T és W aromás oldalláncokat hordozó mutáns csatornák nem reagáltak sem a kámforra, sem a 2-APB-re. A legtöbb R696 mutáns azonban csökkent 2-APB-választ mutatott, de a maximális kámfor (20 mM) válaszok is csökkentek, ami azt jelzi, hogy ezek a mutációk befolyásolják a csatorna általános expresszióját vagy működését (S2. táblázat). Ez az eredmény összhangban van az elsődleges szűrésből származó kezdeti eredményünkkel is, ahol csak a lizin szubsztitúciót azonosítottuk, amely specifikusan szükséges a 2-APB-hez ezen a maradékon. Az R696F szintén mutatott némi 2-APB-specifikus deficitet, bár a maximális kámforválaszokat kissé befolyásolta. Az R696D, R696G, R696N, R696P, R696S és R696T mutánsok a pcDNS vektorral transzfektált sejtekkel összehasonlítva nem mutattak szignifikáns válaszokat sem a 2-APB-ra, sem a kámforra.

A feszültségfüggő válasz érintetlen maradt a 2-APB mutánsokban.

A feszültségfüggőségnek fontos szerepe van a TRP csatorna aktiválásában és kapuzásában (1, 10-12, 21). Kémiai stimulátorok (például kámfor vagy 2-APB) hiányában a -120 és +180 mV közötti feszültséglépések (20 mV-os lépés) nem aktiváltak áramokat a vad típusú TRPV3-mal transzfektált HEK293 sejtekben, ami azt jelzi, hogy a TRPV3 (a TRPV1-től és a TRPM8-tól eltérően) nem aktiválódik pusztán feszültség hatására az itt vizsgált tartományban (20, 22). Azonban 30 μM 2-APB jelenlétében feszültségfüggő áram aktiválódott (S2A ábra). A várakozásoknak megfelelően a TRPV3-H426N-ben 30 μM 2-APB-vel kezelve nem volt kimutatható feszültségmodulált áram (S2B ábra). Azonban 6 mM kámfor feszültségfüggő áramot idézett elő a vad típusú TRPV3-at (V1/2 81,3 ± 2,6 mV) (S2 A és D ábra) és a TRPV3-H426N-t (V1/2 81,3 ± 2,5 mV) expresszáló HEK293 sejtekben (S2 B és D ábra). A TRPV3-H426N-hez hasonlóan a TRPV3-R696K-ban sem volt kimutatható feszültségmodulált áram, amikor 30 μM 2-APB-vel kezelték (S2C ábra). A kámfor azonban feszültségfüggő áramot aktivált, amelynek V1/2 értéke 81,1 ± 5,4 mV volt (S2 C és D ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a TRPV3-H426N és TRPV3-R696K csatornákban a feszültségmoduláció sértetlen, és arra utalnak, hogy a feszültségfüggőség elvesztése valószínűleg nem oka a 2-APB-re adott csökkent válaszoknak ezekben a mutáns csatornákban.

A TRPV3-H426N és TRPV3-R696K hőmérséklet-érzékenysége.

A hőmérséklet-érzékenység a TRPV3 csatornák működésének egyik jellemzője (14, 16, 23). Ezért megkérdeztük, hogy a TRPV3-H426N és TRPV3-R696K klónoknál megváltozott-e a hőmérséklet-aktiváció. A vad típusú TRPV3, TRPV3-H426N vagy TRPV3-R696K mutánssal transzfektált HEK293 sejtek hőmérséklet (25 és 42 °C közötti) aktivációját mértük FLIPR-tesztben. A TRPV3-H426N hőre adott válaszai megegyeztek a vad típusú TRPV3 válaszokkal, vagy valamivel nagyobbak voltak azoknál (n = 4 kísérlet), ami arra utal, hogy a 2-APB- és a hőaktiválás elkülöníthető (S2E ábra; és az adatok nem láthatóak). A TRPV3-R696K hőre adott válaszok azonban sokkal kisebbek voltak a vad típushoz képest (n = 3 kísérlet), ami arra utal, hogy ez a mutáns nem változtatja meg specifikusan a 2-APB aktivációt (S2E ábra).

A TRPV3-R696K kalciumfüggő deszenzitizációja.

A TRPV3-R696K-transzfektált HEK293 sejtekben a 2-APB-válasz érdekes jellemzője a gyors deszenzitizáció >30 μM 2-APB-nél és a 2-APB-re adott off-válasz magas koncentrációknál (S3 ábra). Ez a jelenség ellentétben áll a vad típusú TRPV3-mal, amely ismétlődő/folytonos kémiai vagy hő stimulációra reagálva érzékenyül (14, 16). A TRPV3 szenzitizáció hátterében álló mechanizmust e csatorna kalciumgátlásának elvesztésében javasolják (22). Mivel a legtöbb más TRP-csatorna (például a TRPV1 és a TRPA1) kémiai vagy hőmérsékleti ingerekre történő deszenzitizációja szintén az extracelluláris kalciumtól függ (24, 25), azt kívántuk megvizsgálni, hogy az extracelluláris kalciumnak van-e szerepe a TRVP3-R696K-ban a 2-APB által kiváltott deszenzitizációs válaszokban. Meglepő módon extracelluláris kalcium hiányában 100 μM 2-APB robusztus, vad típusú befelé és kifelé irányuló áramokat aktivált a TRPV3-R696K-ban (TRPV3-R696K áramsűrűség: 755.7 ± 200,0 pA/pF +100 mV-on, -641,2 ± 133,9 pA/pF -100 mV-on (n = 5); vad típusú TRPV3: 615,0 ± 266,7 pA/pF +100 mV-on és -471,0 ± 83,2 pA/pF -100 mV-on, n = 9) (S4 A és B ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy a TRPV3 TRP dobozának 696-os pozíciójában egy arginin lizinnel való helyettesítése a csatornát 2-APB, de nem kámfor stimulációra kalciumfüggő módon deszenzibilizáló állapotba hajtja. A pórushurok doménjében lévő feltételezett Ca2+-kötő maradék, a 641-es aszpartát konzerválódik az összes TRPV-csatorna között, és kritikus a TRP-csatornák permeációs tulajdonságai szempontjából (26, 27). A D641 aszparaginná (N) mutációja bizonyítottan csökkenti a TRPV3 és más TRP-csatornák ruthénvörös blokkját és nagy affinitású extracelluláris kalciumgátlását (17, 22, 26, 27). Ezért megvizsgáltuk, hogy a D641N mutáció képes-e felmenteni a TRPV3-R696K klónt a kalciumfüggő 2-APB-válasz elvesztése alól. FLIPR-tesztben a TRPV3-D641N EC50 értéke 2,8 ± 1,3 μM volt (nHill = 0,7), ami körülbelül fele a vad típusú TRPV3 értékének (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). A kettős mutáns TRVP3-D641N/R696K EC50 értéke 3,3 ± 1,1 μM volt (nHill = 1,1), ami azt mutatja, hogy a D641N mutáció teljesen helyreállította a TRPV3-R696K 2-APB-válaszát. A várakozásoknak megfelelően a kámforválasz hasonló volt a TRPV3, a TRPV3-R696K, a TRPV3-D641N és a TRPV3-D641N/R696K között (S4 C és D ábra). Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy a TRPV3-R696 nem tisztán 2-APB mutáció. A megfigyelt hiányosságok kalcium-mediáltak, és a 2-APB, de nem a kámforválaszokat befolyásolják.

A TRPV3 ortológok 2-APB-érzékenysége.

Az ortológok közötti aminosavkonzervációk és variációk hasznos eszközök a fehérjék, köztük a TRP-csatornák szerkezet-funkció kapcsolatainak feltárására (28, 29). Ezért megkérdeztük, hogy ezek a TRPV3 ortológok hasonló kámfor- és 2-APB-válaszokkal rendelkeznek-e. Valóban, a humán, kutya és béka TRPV3 csatornák, amelyeknek az egérrel egyenértékű 426-os pozícióban hisztidinek vannak (2A ábra), hasonló 2-APB válaszokat mutatnak, amikor HEK293 sejtekben overexpresszálják őket (bár a Xenopus tropicalis TRPV3 kámforválaszai csökkentek a vad típusú egér TRPV3-hoz képest) (2C ábra). A várakozásoknak megfelelően, amikor a H426-ot emberben, kutyában és békában N-re mutálták, a 2-APB koncentráció-válasz görbék erősen jobbra tolódtak mindegyik TRPV3 ortológban (2B ábra). Ez a mutáció ismét nem csökkentette a kámforérzékenységet a vad típusú TRPV3 ortológokhoz képest (2C ábra). Ezzel szemben mind a humán, mind a béka TRPV3 H426N mutánsok kámforérzékenysége kissé magasabb volt, mint a vad típusú társaiké. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a TRPV3 2-APB aktiválási mechanizmusa konzerválódhat a különböző fajokban.

Érdekes módon, bár az R696 konzerválódik a TRPV3 TRP dobozában minden fajnál, a csirke TRPV3 (cTRPV3) egér 426-nak megfelelő pozíciója egy N (427). Amint azt fentebb bemutattuk, a H-N szubsztitúció a 426-os maradékban az emlős vagy kétéltű fajokban zavarja a megfelelő 2-APB-válaszokat (2A ábra). Összhangban azzal, hogy ez a maradék fontos a 2-APB-válaszok szempontjából, a 2-APB EC50 értéke a cTRPV3-ban 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5), szemben az egér TRPV3 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) értékével. Feltűnő, hogy az N427 H-ra történő mutációja jelentősen balra tolta a 2-APB koncentráció-válasz görbéjét (EC50 6,1 ± 0,9 μM, nHill = 2,3), míg a kámfor EC50 értéke változatlan maradt (3A ábra). Az egészsejtes patch clamp felvétel megerősítette, hogy a 2-APB koncentráció-válasz görbe erősen balra tolódott a csirke TRPV3-N427H-ban a vad típusú cTRPV3-hoz képest mind +100, mind -100 mV-on (3B ábra). Az egycsatornás felvételek 25 μM 2-APB hatására a csatornanyitások közel 200-szoros növekedését mutatták a bazális szinthez képest a cTRPV3-N427H-t expresszáló sejtekből származó inside-out foltokban (n = 7), míg a vad típusú cTRPV3-t expresszáló HEK293 sejtekből származó inside-out foltokban (n = 5) nem tapasztaltunk jelentős változásokat. A vad típusú cTRPV3-mal vagy a cTRPV3-N427H mutánssal transzfektált HEK293 sejtek inside-out foltjaiban azonban 6 mM kámfor erősen megnövelte az egycsatorna-nyitásokat, hasonló szinten (3. ábra C-E). Ezért a csirke TRPV3 egyetlen pontmutációja specifikusan növeli a 2-APB iránti érzékenységét.