Míg a fehérje próbáknak számos felhasználási területe van az élettudományi kutatásokban, nincs egyetlen olyan vizsgálati módszer, amely minden alkalmazáshoz alkalmas. A modern tudomány minden fejlődése ellenére nem létezik olyan fehérje vizsgálati módszer, amelyet nem befolyásolnak a nem fehérje komponensek vagy a fehérje összetételének különbségei. Emiatt a fehérje laboratóriumok szükségesnek tartják, hogy a kutatási alkalmazásokhoz egynél többféle fehérjetesztet használjanak.
Minden tesztnek megvannak a maga előnyei és korlátai. Ezért, ha pontos eredményeket szeretne kapni a kísérletéből, ki kell tudnia választani az alkalmazásához legmegfelelőbb próbát.
A kolorimetrikus fehérjemérések típusai
A kémia alapján az összfehérje kolorimetrikus kimutatására és mennyiségi meghatározására szolgáló két legelterjedtebb módszer a fehérje-festékkötéses próba és/vagy a rézion-alapú kelációs próba.
Festékkötési próbák
A festékkötési próbák, mint például a Bradford (Coomassie) és a 660 nm-es fehérje próbák, a fehérjemolekulák Coomassie festékhez való kötődésén alapulnak savas körülmények között. Amint a fehérjemolekulák kötődnek a festékhez, a szín a barnáról (Amax= 465nm) kékre (Amax= 610nm) változik. A színsűrűség változása (amely 595nm-en olvasható le) arányos a fehérje koncentrációjával.
A bázikus aminosavak (arginin, lizin és hisztidin) fontos szerepet játszanak a festék-fehérje komplexek kialakulásában és az ebből eredő spektrális eltolódásban, míg a kisebb fehérjék (3kDa-nál kisebb) és aminosavak nem okoznak színváltozást.
Rézion alapú vizsgálatok
A rézion alapú fehérjemérésekben a fehérjeoldatot rézsó lúgos oldatával keverik össze, hogy megkönnyítsék a rézionok (Cu2+) kelátképzését a peptidkötésekkel, majd a rézionok (Cu2+) ezt követő redukcióját rézionokká (Cu+). A felesleges rézionok nem kötődnek a peptidkötésekhez, és a kimutatáshoz rendelkezésre állnak.
A rézionokon alapuló fehérjeanalízisek két csoportra oszthatók: (1) a redukált kuperionokat (Cu+) és (2) a nem kötött kuperionokat (Cu2+) kimutató analízisek. A bikinkoninsav (BCA) vagy a Folin-reagens (foszfomolibdénsav/foszfovolframsav) használható a kuperionok kimutatására. A használt reagens redukciója során kék szín keletkezik. A keletkező szín mennyisége 650 nm és 750 nm között leolvasható, és arányos a peptidkötések mennyiségével.
Megjegyzés: A fehérjében lévő tirozin, triptofán, cisztein, hisztidin és aszparginin jelenléte fokozza a keletkező színsűrűséget.
A nem kötött rézionok kimutatásán alapuló vizsgálatokban a fehérjeoldathoz lúgos rezet kevernek, majd a nem kötött rézionokat a rézionokkal reagáló, színt előállító reagenssel detektálják. A keletkező szín mennyisége fordítottan arányos a mintában lévő peptidkötés mennyiségével.
A fehérje próbák kiválasztása: Néhány figyelembe veendő tényező
Az assay kiválasztásakor számos tényezőt kell figyelembe vennie. Íme néhány ezek közül.
- Kompatibilitás a minta típusával és összetevőivel. A fehérjeminta jellege és a fehérjeoldatokban lévő nem fehérje hatóanyagok jelenléte jelentősen befolyásolhatja a kísérlet eredményeit. Tartsa szem előtt, hogy a redukálószerek, fémkelátképző szerek, színezékek, aminok és cukrok jelenléte zavarja a rézalapú fehérjevizsgálatokat, míg a detergenseket tartalmazó fehérjeoldatok zavarják a festékalapú fehérjevizsgálatokat.
- Vizsgálati tartomány és szükséges mintamennyiség. A legtöbb kolorimetriás vizsgálathoz legalább 0,5 µg fehérje szükséges a megbízható becsléshez. Ezért a nehezen beszerezhető minták esetében olyan módszereket kell megfontolni, amelyek a legkevesebb mintamennyiséget igénylik a megbízható becsléshez.
- Fehérje-fehérje egyenletesség. A festékalapú fehérjeméréseknél és a rézionok rézionokká történő redukcióját alkalmazó vizsgálatoknál jelentős a fehérjék közötti eltérés.
- Időbeli megfontolások. A minta összetettsége és a választott vizsgálati módszer diktálja a fehérjemérés elvégzéséhez szükséges időt. A zavaró anyagokat tartalmazó fehérjeminták és a standard ábrákat vagy görbéket használó vizsgálatok több időt emésztenek fel.
- Műszerigény. A vizsgálat által termelt szín (abszorbancia) méréséhez szükséges spektrofotométer vagy lemezolvasó rendelkezésre állása szintén befolyásolhatja a választását.
