Mivel a fehérjék pontos mennyiségi meghatározása elengedhetetlen a fehérjék vizsgálatával kapcsolatos minden kísérlethez, különböző módszereket fejlesztettek ki a fehérjék koncentrációjának mérésére egy adott vizsgálatban. A teljes fehérje mennyiségi meghatározásának néhány hagyományosabb módszere közé tartozik a 280 nm-en mért UV-abszorbancia (A280), a Bicinchoninic acid (BCA) és a Bradford-mérések, valamint más alternatív módszerek, például a Lowry- és más újszerű mérések.
Mivel a fehérjék egy adott hullámhosszon elnyelik a fényt, a mérés spektrofotométerrel végezhető. Különösen a tirozin és a triptofán aminosavaknak van egy nagyon specifikus abszorpciójuk 280 nm-en, ami lehetővé teszi a fehérjekoncentráció közvetlen A280 mérését.
A 280 nm-es UV abszorpciót rutinszerűen használják a fehérjekoncentráció becslésére a laboratóriumokban az egyszerűsége, könnyű használhatósága és megfizethetősége miatt. A mérések gyorsak és nagymértékben reprodukálhatók, mivel nincs szükség inkubációra. Ezenkívül ez a módszer rendkívül kis mintatérfogatot is igényel, mivel a modern spektrofotométerek a mérés során mintaretenciós rendszert használnak.
Azt azonban biztosítani kell, hogy a fehérjeminta ne tartalmazzon olyan nem fehérje komponenseket (pl. nukleinsavakat), amelyeknek azonos az abszorpciós spektruma, mivel ez hibás eredményekhez vezethet. A fehérjekoncentráció meghatározásán kívül az abszorbanciaértékek a konformációs változások és a ligandumkötés kimutatására, valamint az enzimreakciók követésére is felhasználhatók.
A triptofán és a tirozin hatása a fehérje mennyiségi meghatározásában
A tirozin és triptofán jelenléte miatt az ezeket az aromás aminosavakat tartalmazó fehérjék és peptidek 280 nm-es hullámhosszon elnyelik az UV-fényt. E maradékok mindegyike eltérő abszorpciós és emissziós hullámhosszal rendelkezik, és kvantumhozamuk is eltérő. A fenilalanin és a diszulfidkötések is hozzájárulnak az ezen a hullámhosszon történő abszorpcióhoz, de mivel ez viszonylag jelentéktelen, csak triptofán és tirozin hiányában figyelhető meg.
Sok aromás gyűrűs szerkezetet tartalmazó enzimatikus kofaktor (pl. FMN, FAD, NAD és porfirin) is elnyeli az UV-fényt a gerjesztéshez, és ezért hozzájárul a keletkező fluoreszcencia intenzitásához. A speciális fehérjék, mint például a zöld fluoreszcens fehérje, egy belső szerinetyrozin-glicin szekvenciával is rendelkeznek, amely poszttranszlációsan módosul, és a látható fény tartományában fluoreszkál.
Triptofán
A triptofán lényegesen jobban fluoreszkál, mint a tirozin és a fenilalanin. Fluoreszcens tulajdonságai azonban oldószerfüggőek, azaz a spektrum rövidebb hullámhosszra tolódik és intenzitása nő az oldószer polaritásának csökkenésével. Így a hajtogatott fehérjék hidrofób doménjeiben eltemetett triptofánmaradványok 10-20 nm-es spektrális eltolódást mutatnak.
A nagyobb abszorpciós képesség, a nagyobb kvantumhozam és a rezonanciaenergia-átvitel miatt a három aminosavat tartalmazó fehérje fluoreszcencia spektruma általában hasonlít a triptofánéhoz.
Tyrozin
A tirozin a triptofánéhoz hasonló hullámhosszon gerjeszthető, de határozottan más hullámhosszon fog emittálni. Bár igaz lehet, hogy a tirozin kevésbé fluoreszkál, mint a triptofán, mégis jelentős jelet adhat, mivel gyakran nagy mennyiségben van jelen sok fehérjében. Megfigyelték, hogy a tirozin fluoreszcenciáját a közeli triptofánrészek jelenléte kioltja, akár rezonancia-energiatranszfer, akár aromás hidroxilcsoportjának ionizációja révén.
Az A280 módszerrel történő peptidmérés során néhány fontos szempontot kell szem előtt tartani.
- A hasonló molekulatömegű fehérjék abszorbanciaértékei eltérőek lehetnek a triptofán- és tirozintartalom különbsége miatt.
- Az UV-abszorbanciát a fehérjék szerkezete is befolyásolja. Így a szerkezetet befolyásoló körülmények (például a hőmérséklet, a pH, az ionerősség vagy a detergensek jelenléte) befolyásolhatják az aromás maradékok fényelnyelő képességét 280 nm-en, és megváltoztathatják a fehérje extinkciós együtthatójának értékét.
- Az aromás aminosavak helyi környezete hatással lehet a spektrumukra. Ez azt jelenti, hogy a triptofánnak alacsonyabb hullámhosszon lesz emissziós csúcsa, ha a fehérje hidrofób belső régióiban van eltemetve, míg a tirozin gyakran átadja energiáját a szomszédos triptofán aminosavaknak. Az ionizált tirozinát, amely akkor keletkezik, amikor a pH növekedése következtében a tirozinból protonok vesznek el, a triptofánhoz hasonló hullámhosszt mutat.