A piroszekvenálás a DNS-szekvenálás (a DNS-ben lévő nukleotidok sorrendjének meghatározása) olyan módszere, amely a “szintézissel történő szekvenálás” elvén alapul, amelyben a szekvenálás a DNS-polimeráz által beépített nukleotid kimutatásával történik. A piroszekvenálás a pirofoszfát felszabadulásakor bekövetkező láncreakción alapuló fénydetektálásra támaszkodik. Innen ered a piroszekvenálás elnevezés.
A piroszekvenálás elvét először 1993-ban írta le Bertil Pettersson, Mathias Uhlen és Pål Nyren, amikor a sztreptavidin bevonatú mágneses gyöngyöket használó szilárd fázisú szekvenálási módszert kombinálta a 3´-5´-exonukleáz aktivitást (proof-reading) nélkülöző rekombináns DNS-polimerázzal és a szentjánosbogár luciferáz enzimet használó lumineszcens detektálással. A szekvenálandó egyszálú DNS-hez három enzim (DNS-polimeráz, ATP-szulfuriláz és szentjánosbogár-luciferáz) és egy nukleotid (dNTP) keverékét adjuk, és a nukleotid beépülését a kibocsátott fény mérésével követjük. A fény intenzitása határozza meg, hogy 0, 1 vagy több nukleotid épült-e be, így megmutatja, hogy hány komplementer nukleotid van jelen a templát szálon. A nukleotidkeveréket eltávolítják, mielőtt a következő nukleotidkeveréket hozzáadnák. Ezt a folyamatot mind a négy nukleotiddal megismétlik, amíg meg nem határozzák az egyszálú templát DNS-szekvenciáját.
A pyroszekvenálás másik oldat alapú módszerét 1998-ban írta le Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen és Pål Nyren. Ebben az alternatív módszerben egy további enzimet, az apirázt vezetik be a DNS-polimeráz által be nem épített nukleotidok eltávolítására. Ez lehetővé tette, hogy a DNS-polimerázt, a luciferázt és az apirázt tartalmazó enzimkeveréket az eljárás kezdetén adják hozzá, és az eljárás során végig megőrizzék, így egy egyszerű, automatizálásra alkalmas elrendezést biztosítva. Az ezen az elven alapuló automatizált műszert a következő évben a Pyrosequencing cég dobta piacra.
A Pyrosequencing módszer harmadik mikrofluidikus változatát 2005-ben Jonathan Rothberg és munkatársai a 454 Life Sciences cégnél írták le. A Pyrosequencing ezen alternatív megközelítése azon az eredeti elven alapult, hogy a szekvenálandó DNS-t szilárd hordozóra rögzítik, és megmutatták, hogy a szekvenálás nagymértékben párhuzamosan végezhető egy mikrogyártott microarray segítségével. Ez lehetővé tette a nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálást, és egy automatizált műszert vezettek be a piacra. Ez lett az első újgenerációs szekvenáló eszköz, amely új korszakot indított a genomikai kutatásban, a DNS-szekvenálás gyorsan csökkenő árai pedig lehetővé tették a teljes genom szekvenálását megfizethető áron.