Új mikroorganizmus-izolálási technikák, különös tekintettel a lézernyomtatásra | CDhistory

Új izolálási módszerek

Ma már sokféle módszert alkalmaznak új, korábban nem kultivált mikroorganizmusok kimutatására. Különösen új, speciális anyagokat tartalmazó tápközegeket használnak; a tenyésztést a környezet különböző fizikai és kémiai körülményei között végzik, mint például a légköri összetétel, a hőmérséklet és a pH. Tanulmányozták továbbá a hígított tápközegek alkalmazását hosszú inkubációs időszakokkal kombinálva, valamint a különböző fajokhoz tartozó mikroorganizmusok együttes termesztését. Az utóbbi években néhány alapvetően új termesztési módszert fejlesztettek ki, amelyek a mikroorganizmusok természetes környezetbe történő elhelyezésén alapulnak, tápközegek használata nélkül. Az ilyen módszerek diffúziós kamrákat és polimer bevonatokat használnak, amelyekben mikrobiális sejteket helyeznek el. Ebben az esetben a mikroorganizmusok minden szükséges tápanyagot a természetes környezetből kapnak, attól elszigetelve maradnak. Egy új antibiotikum-termelő (teixobaktin) ilyen módszerekkel történő kiosztása fontos eredménynek tekinthető. Egy másik megközelítés több tíz- és százezer baktérium mikrokolónia egyidejű tenyésztését és szűrését tartalmazza porózus polimer vagy kerámia izolációs chipeken. A “nem tenyészthető” mikroorganizmusok tenyésztésére olyan módszerek is alkalmazhatók, amelyek lehetővé teszik az egyes sejtek izolálását természetes környezetből. E módszerek közül a legnépszerűbbek a mikroorganizmus-szuszpenzió hígításán, az áramlási citometrián és a sejtválogatáson, a lézeres mikrodissectión, a kompartmentáláson és a mikromanipulátorok alkalmazásán alapulnak. A korábban nem kultivált mikroorganizmusfajok tenyésztése mellett az egyes mikrobiális sejtek izolálása szükséges a sejtfiziológia, a sejtek közötti kölcsönhatások, valamint az új metabolitok, például antibiotikumok és enzimek kutatásához.

A modern tudományos és technológiai fejlődés számos lehetőséget biztosít az egyes baktériumsejtek és konzorciumaik tenyésztésére, izolálására, manipulálására és tanulmányozására szolgáló új módszerek kifejlesztése szempontjából. Az új megközelítések jelentősen felgyorsíthatják a mikroorganizmusokkal való munka folyamatát, és lehetővé tehetik azok teljesebb és átfogóbb vizsgálatainak elvégzését. Meg kell jegyezni, hogy eddig nagyon kevés módszert javasoltak a baktériumtömbök mikrométeres pontosságú pozícionálására. Akselrod és munkatársai élő sejtek háromdimenziós (3D) hálózatait hidrogélben életképességük elvesztése nélkül alakították ki multiplexált holografikus optikai csapdák (csipeszek) tömbjei segítségével, eddig nem látott pontossággal (<400 nm). Az optikai csapdák kialakításához két lézert használtak: Ar+ lézer (20 W, 514 nm hullámhossz) és folyamatos hullámú Ti:Zafír lézer, amely a λ = 850-900 nm tartományban hangolható, valamint két diffrakciós elem kombinációja, különböző lencsékkel kombinálva egy fordított optikai mikroszkópban. Baktériumgyűrűvel körülvett 3T3 fibroblasztok hálózatai alakultak ki. Azt is demonstrálták, hogy egyszerre több száz Pseudomonas aeruginosa baktériumot képesek manipulálni kétdimenziós (2D) és 3D-s tömbökben. A holografikus optikai csapdázás módszere nagyon pontos, de technikailag nehezen kivitelezhető.

A Rowan és munkatársai tanulmányában a felületek heterogén funkcionalizálásának módszerét javasolják, amely egy négylépéses litográfiai folyamat, amely szerves monorétegek mikrokontakt nyomtatásán, hiperelágazó polimer beültetésén és annak további funkcionalizálásán alapul. Ennek eredményeként olyan struktúrákat kapunk, amelyeken baktériumsejtek irányított beoltása történik. A sejtek túlélésére vonatkozó vizsgálatok azt mutatták, hogy a sejtek életképesek maradnak a kapott strukturált felületeken. Nagyméretű, 18 ± 5 baktériumot tartalmazó baktériumizolátumokat és kisméretű, 2 ± 1 baktériumot tartalmazó baktériumizolátumokat nyertek. A dolgozat szerint a bemutatott módszer nagy áteresztőképességű szűrésre és bioszenzálásra használható. A felületek heterogén funkcionalizálását ezzel a módszerrel azonban nehéz összeegyeztetni a rutinszerű biológiai kutatásokkal és a mikroorganizmusok tenyésztésének körülményeivel (hőmérséklet, pH, tápanyagok stb.). Meg kell jegyezni, hogy néhány publikációban megoldották azt a feladatot, hogy egyszerű módot találjanak az élő baktériumtömbök nagy felbontásának biztosítására a különböző biológiai vizsgálatok lehetőségével. Az ezekben a munkákban javasolt megközelítések tulajdonképpen a 3D nyomtatás előfutárai.

A Weibel et al. tanulmányában az élő baktériumok agarózlemezekre történő bélyegzésének technikáját javasolták. Baktériumtömböket nyomtattak (egyetlen baktériummal ellátott folt mérete >200 µm) akár 50 cm2 -es területen. A polidimetil-sziloxán (PDMS) bélyegeket fotolitográfiai technikával állították elő. A lenyomat kiemelkedésének elért minimális mérete 190 µm volt 140 µm magasságban, ami azonban messze elmarad a baktériumok elkülönítéséhez szükséges mérettől. Ez a módszer gyors, reprodukálható és kényelmes, és használható a különböző baktériumok kolóniái közötti minta, távolság és orientáció ellenőrzésére. Xu és munkatársai tanulmányában sejtfelbontású élő baktériumtömböket nyomtattak agaróz szubsztrátra nagy oldalarányú elasztomer (PDMS) bélyegek segítségével, amelyeket a fordított in situ litográfia (RISL) módszerével nyertek. Az 1. ábra mutatja a RISL módszer előnyeit a hagyományos ultraibolya fotolitográfiával szemben. A RISL-technológia egyetlen korlátja a kiemelkedés átmérője, amely az optikai diffrakciós határ miatt alig lehet <1 µm.

A baktériumtömbök mikrokontakt nyomtatásának módszere a következőképpen működik: Az LB táptalajban lévő Escherichia coli cseppet agarózgélre (3 tömegszázalék LB-ben) helyezzük, és az agaróz szubsztrátumon baktériumok monorétege alakul ki (a folyadékot az agarózgél elnyeli). Ezután a PDMS-bélyegző érintkezik az agarózgélt borító baktériumok egyrétegű rétegével. A bélyeget eltávolítjuk, és a baktériumok egy része rajta marad. Ezután a bélyegzőnek az agaróz gélréteggel (4 tömegszázalék LB-ben, vastagsága 200 µm) való érintkezésekor a baktériumok átkerülnek az agarózrétegre. Így néhány másodperc alatt az E. coli baktériumok tömbjei közvetlenül az agaróz szubsztrátumra nyomtathatók mikronos felbontással, akár egyetlen baktériumig, nagy felületen (cm2). Kimutatták, hogy a minta nyomtatása után a baktériumok tovább növekednek és osztódnak, mint a tömegkultúra körülményei között, azaz a baktériumok a nyomtatás után is megőrzik normális fiziológiai viselkedésüket. Azt is kimutatták, hogy az agaróz koncentrációja döntő fontosságú a jó nyomtatási teljesítmény szempontjából. A túl alacsony koncentráció a nyomtatott minta torzulásához vezet, míg a túl magas koncentráció nem alkalmas a baktériumok tenyésztésére. Az egyes baktériumokból álló tömbök előállítása érdekében vizsgálták a kezdeti baktériumkoncentráció csökkentésének hatását az LB táptalaj egy cseppjében. A 109 és 108 sejt/ml kezdeti koncentráció esetén a foltonkénti átlagos baktériumszám 12,1, illetve 1,4 volt. A baktériumok alacsony koncentrációjánál nagyon szűk eloszlást kaptunk: A foltok 44,6%-ában csak egy E. coli sejt volt, és a foltok 40,1%-ában 0 vagy 2 sejt volt. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a mikrokontakt nyomtatás lehetővé teszi az egyes baktériumok szabályos tömbjeinek előállítását. Továbbá kimutatták, hogy a baktériumtömbök elválasztásának ez a megközelítése lehetővé teszi az egyes baktériumsorok növekedési sebességének elemzését. Ez a módszertan egyszerű módot biztosít a baktériumok bármilyen kívánt térbeli 2D eloszlásához, és felhasználható mind szűrésre, mind a bakteriális fenotípusos variáció, a populációdinamika és az ökoszisztémák evolúciójának vizsgálatára.

Egy gyorsan fejlődő terület – a szociomikrobiológia – azonosította azokat a mechanizmusokat, amelyek segítségével a baktériumok együttműködő és versengő kapcsolatokban vesznek részt azáltal, hogy fizikai érintkezés és a közös mikrokörnyezetük kémiai összetételének módosítása révén befolyásolják a közeli szomszédokat. A kis mikrobiális aggregátumok viselkedésének feltárására különböző mikrofeldolgozási technológiákat fejlesztettek ki, amelyek a baktériumokat mikrofluidikai eszközökben, mikrorezonátorokban és ultra kis térfogatú folyadékcseppekben korlátozzák. Az analitikai rendszerek mikrofluidikával való integrálásának képessége vonzóvá tette ezeket az izolációs platformokat az antibiotikum-rezisztencia nagy teljesítményű szűrésére és az enzimaktivitás elemzésére. Eun és munkatársai például az agaróz mikropartikulákba kapszulázott baktériumsejtek nagy teljesítményű elemzését és izolálását írják le fluoreszcens sejtválogatás (FACS) alkalmazásával. A ≈30 µm átmérőjű monodiszperz mikropartikulumok előállításához áramlásfókuszáló mikrofluidikai rendszereket használtak. E részecskék mérete kompatibilissé tette őket az áramlási citometriával és a FACS-szel, és e módszerek érzékenysége csökkentette a sejtek szaporodásához szükséges inkubációs időt az elemzések elvégzése előtt. A mikrorészecskék kis térfogata (≈1-50 pikoliter ) minimalizálta a baktériumvizsgálatokhoz szükséges reagensek számát. Ez a platform lehetővé tette a baktériumok hatékony kiosztását és izolálását, valamint a módszerek kombinációjának alkalmazását a biológiailag aktív kis molekulák célpontjainak gyors azonosítására. A módszer kísérleti demonstrációjaként E. coli sejteket agaróz mikropartikulumokba kapszuláztak, különböző koncentrációjú rifampicin jelenlétében inkubálták, és FACS segítségével elemezték. Meghatároztuk a rifampicin minimális gátló koncentrációját, és FACS segítségével izoláltuk az antibiotikum-rezisztenciával rendelkező spontán mutánsokat, amelyeket DNS-szekvenálással jellemeztünk. Ezzel a megközelítéssel a mutánsok izolálásához szükséges idő és antibiotikum-mennyiség 8-szorosára, illetve 150-szeresére csökkent a hagyományos, tápanyag-agar lemezeket használó mikrobiológiai módszerekhez képest. Így ez a módszer fontos a kémiai biológia, a természetes termékek kémiája, valamint a biológiailag aktív másodlagos metabolitok felfedezése és jellemzése szempontjából.

A fent említett megközelítések hasznosak voltak a méret, az alak és a fizikai jellemzők (mikrohabitat) korlátozására, azonban egyik sem adott lehetőséget a bakteriális aggregátumok 3D geometriájának vagy több populáció orientációjának tetszőleges meghatározására. Ráadásul a sejtek ultra kis térfogatú üregekbe való beékelődésének folyamata gyakran korlátozza a tömegközlekedést, ami a fizikailag izolált populációk közötti növekedéssel és jelátvitellel összeegyeztethetetlen körülményekhez vezet. Egyre több bizonyíték világít rá a mikrokolóniák fontosságára a baktériumok szaporodásában; ugyanakkor megfigyelhető az ilyen közösségekben a sejtek viselkedésének szisztematikus értékelésére szolgáló eszközök hiánya. A 3D kulturális környezet mikroszkopikus léptékű létrehozására szolgáló új stratégiák döntő szerepet játszhatnak annak azonosításában, hogy a baktériumok hogyan kezelik az antibiotikum-rezisztenciát és más szociális viselkedést a kis sűrű aggregátumokban.

A Connell és munkatársai és Connell és munkatársai a mikroszkopikus 3D kamrák lézeres kialakításának multifoton litográfián (MPL) alapuló módszerét ismertetik. Az MPL-módszer nagy áteresztőképességgel és tetszőleges minták előállításának képességével rendelkezik. Lehetőséget kínál 3D mikroeszközök, például mikrooptikai alkatrészek, szövettechnikai állványok és mikrofluidikai chipek ipari előállítására. Connell és munkatársai tanulmányában mikroszkopikus 3D baktériumkamrák létrehozásához szarvasmarha-szérumalbumin (BSA), egy jól oldódó, porózus, tartós és biokompatibilis hidrogéllé térhálósítható fehérjét használtak. Néhány különálló baktériumot 1 pl térfogatú BSA-kamrákba zártunk, majd klónpopulációkban növesztettük őket. A BSA falán keresztül a biológiailag jelentős molekulák és antibiotikumok diffúziója, valamint a kvórumérzékeny jelek cseréje miatt a baktériumközösségek szociális viselkedését vizsgálták a populáció méretének és sűrűségének, a tartály alakjának és a környezet áramlási sebességének függvényében.

Az emberi szervezetben a baktériumok általában több baktériumfajból álló, strukturált 3D közösségekben élnek. A geometria patogenitásra gyakorolt hatásáról való részletes tájékozódás érdekében Connell és munkatársai olyan 3D nyomtatási stratégiát írnak le baktériumközösségekre, amelyben fizikailag elkülönülő, de kémiailag interaktív, meghatározott méretű, alakú és sűrűségű populációk szervezhetők lényegében bármilyen formába (2. ábra). Ezt a megközelítést alkalmazva kimutatták, hogy egyetlen patogén baktériumfaj antibiotikummal szembeni stabilitása a 3D-s kapcsolatuk miatt fokozhatja a második faj rezisztenciáját. A lézer litográfiai technika segítségével zselatinban szuszpendált kiválasztott baktériumok körül legfeljebb 1 pl térfogatú, legfeljebb 2 µm vastagságú tartályfalú mikroszkopikus konténereket alakítottak ki a polipeptid molekuláknak a fókuszterületen a lézersugárzás fényérzékenyítő molekulák általi nemlineáris elnyelése miatti térhálósodásával. Ennek a multifoton abszorpciónak az eredménye a szingulett oxigén képződése, amely serkenti a BSA és a zselatin közötti intramolekuláris és intermolekuláris kovalens keresztkötési reakciókat. A zselatin egyedülálló fizikai és kémiai tulajdonságai motiválták az érdeklődést a különféle alkalmazásokban való felhasználása iránt, beleértve a baktériumok tárolását, immobilizálását és 3D-s tenyésztését. A felesleges reagens eltávolítása után a baktériumokat a keresztkötésű zselatin által kialakított zárt üregekben lokalizálják, amely rendkívül porózus anyag, és támogatja a teljesen zárt sejtpopulációk gyors növekedését. Könnyen átjárható a polipeptidek, antibiotikumok, valamint azon fizikai és kémiai jelek számára, amelyek segítségével a baktériumok közötti kölcsönhatás létrejön. A sejtek mikrokonténerekbe történő izolálása lehetőséget biztosít a különböző típusú/sűrűségű konténerek egymásba ágyazására, valamint a közösségen belüli teljes baktériumpopulációk orientációjának dinamikus megváltoztatására.

A szerzők kimutatták, hogy a Gram-pozitív Staphylococcus aureus és a Gram-negatív P. aeruginosa baktériumok (két humán kórokozó, amelyek gyakran képeznek tartós társfertőzést a sebek, katéterek és a mucoviscidosisban szenvedő betegek tüdejében) térbeli lokalizált kölcsönhatásai növelhetik a Staphylococcus túlélését a β-laktám antibiotikumokkal történő kezelés során.

A mikro-3D sejtnyomtatás alapvetően kibővíti az antibiotikum-rezisztencia vizsgálatának lehetőségeit, amikor egyetlen baktérium mikrocsoport befolyásolhatja a szomszédos környező vagy beágyazott populációk antibiotikum-érzékenységét – ami különösen fontos az in vivo fertőzések esetében (pl, sebek, szájüreg és cisztás fibrózisos tüdő), ahol a szöveteket gyakran egyszerre több baktériumfaj kolonizálja. A 3D-s sejtnyomtatás igazi ereje abban rejlik, hogy a mikrobiális közösségeket korlátlan számú geometriában lehet megszervezni. A mikro-3D sejtnyomtatás értékes eszköz lehet a környezeti körülményekre adott adaptív válaszok mechanizmusainak és dinamikájának vizsgálatában is.