3D nyomtatott bionikus fülek | CDhistory

A kibernetikaként ismert bionikus szervek és az emberi képességeket javító eszközök tervezése és megvalósítása egyre nagyobb tudományos érdeklődésre tart számot.1,2 Ez a terület lehetőséget kínál arra, hogy testre szabott pótalkatrészeket hozzon létre az emberi test számára, vagy akár olyan szerveket hozzon létre, amelyek az emberi biológia által biztosított képességeken túlmutató képességekkel rendelkeznek. Különösen a funkcionális elektronikus alkatrészek biológiai szövetekkel és szervekkel való közvetlen, többdimenziós integrációját célzó megközelítések kifejlesztése lehet óriási hatással a regeneratív gyógyászat, a protézisek és az ember-gép interfészek területén.3,4,4 A közelmúltban több jelentés is beszámolt az elektronika és a szövetek összekapcsolásáról rugalmas és/vagy nyújtható síkbeli eszközök és érzékelők segítségével, amelyek alkalmazkodnak a szövetek felületéhez, lehetővé téve olyan alkalmazásokat, mint a biokémiai érzékelés és az elektromos aktivitás szondázása a szív,5 a tüdő,6 az agy,7 a bőr8 és a fogak felületén.9 A biológiai szövetekkel és szervekkel zökkenőmentesen összefonódott háromdimenziós elektronikus komponensek elérése azonban lényegesen nagyobb kihívást jelent.4

A szövetszerkesztést az az elv vezérli, hogy a különböző sejttípusok új szövetek szintézisére késztethetők, ha megfelelő háromdimenziós hidrogél állványzatra ültetik őket megfelelő növekedési környezetben.10-15 Az in vivo vagy in vitro tenyésztést követően olyan szöveti struktúrák alakulnak ki, amelyek rendelkeznek az eredeti állványzat morfológiájával.16 A hagyományos szövettechnológiai megközelítések egyik legnagyobb kihívása azonban a sejtekkel beültetett implantátumok előállítása, amelyek struktúrája a natív szövetet utánozza, mind az anatómiai geometria, mind a szöveten belüli sejteloszlás tekintetében.17 Az olyan technikákat, mint a sejtek nem tapadó formákba vagy önhajtogató állványokba történő beültetése, már alkalmazták komplex 3D geometriájú háromdimenziós szövetszerkezetek előállítására.18,19 A meglévő technikák azonban még mindig képtelenek olyan szerv- vagy szövetrészek egyszerű létrehozására, amelyek a szükséges térbeli heterogenitással és pontos anatómiai geometriával rendelkeznek, hogy megfeleljenek a transzplantációra szánt donorszervek hiányának.20-22 Például a külső fül teljes rekonstrukciója autogén porccal – amelynek célja a kontralaterális fülkagylóhoz hasonló megjelenésű fül újraalkotása – továbbra is az egyik legnehezebb probléma a plasztikai és rekonstrukciós sebészet területén23.

Az olyan additív gyártási technikák, mint a 3D nyomtatás, potenciális megoldást kínálnak a számítógépes tervezésű (CAD) modellek gyors létrehozásának lehetőségén keresztül, rétegekre szeletelve és a rétegeket felfelé építve, biológiai sejteket tintaként használva, az emberi szervek pontos anatómiai geometriájában.24-27 A 3D-nyomtatás variációit már használták a szilárd szabadformájú gyártás módszereiként, bár alkalmazása főként passzív mechanikai alkatrészek létrehozására korlátozódott.24,28 Az extrudáláson alapuló 3D-nyomtatást keményszövet-állványok, például térdmeniszkek és porckorongok készítésére használták, kapszulázott sejtekkel kiegészítve.29-31 Ez a technika lehetővé teszi térben heterogén, több anyagból álló szerkezetek létrehozását olyan lerakóeszközök alkalmazásával, amelyek képesek az anyagok széles skáláját extrudálni.32 Továbbá a nanoméretű funkcionális építőelemek lehetővé teszik a hangolható funkcionalitással rendelkező makroszintű komponensek sokoldalú, alulról felfelé történő összeállítását. Ez lehetővé teheti a nanoelektronikai anyagok és biológiai sejtek egyidejű nyomtatását, hogy háromdimenziósan integrált, egyedi képességekkel rendelkező kiborgszövetek és szervek jöjjenek létre.33,34

Itt egy koncepcionálisan új megközelítést mutatunk be, amely a fent említett kihívásokat a funkcionális elektronikus komponensek és a biológiai szövetek teljes összefonódásával kezeli, nanoelektronikai anyagok és életképes sejtekkel beültetett hidrogélek 3D nyomtatásával az emberi szervek pontos anatómiai geometriájában. Mivel az érzékelő és információfeldolgozó eszközök középpontjában az elektronikus áramkörök állnak,35 a nyomtatott hibrid architektúra in vitro tenyésztése lehetővé teszi olyan “kiborgszervek” növekedését, amelyek az emberi biológiához képest továbbfejlesztett funkciókat mutatnak. Megközelítésünk lehetővé teszi a térbeli heterogén szerkezetek meghatározását és létrehozását az anyagok széles skálájának rétegenkénti extrudálásával, amíg a végső sztereolitográfiai geometria el nem készül. Az élő sejtek és az elektronikai alkatrészek 3D nyomtatásának és funkcionális szervekké történő növesztésének koncepciója új irányt jelent az elektronika és a biológiai rendszerek egyesítésében. Az ilyen kiborgszervek valóban különböznek a mesterséges szövetektől vagy a konformális síkbeli/hajlékony elektronikától, és egyedülálló módját kínálják az elektronika és a szövetek háromdimenziós egyesülésének.

A megközelítés koncepciójának bizonyítékaként értékeltük, hogy a 3D nyomtatás képes-e olyan életképes fülkagylót létrehozni, amely az emberi hallás alternatív képességeit lehetővé tevő elektronikát is tartalmaz. A túlnyomórészt porcszövetből álló emberi szervek, mint például a fülfülkagyló, megfelelő prototípusjelölteket jelentenek a megközelítésünk megvalósíthatóságának vizsgálatára. Ennek oka 1) a fül anatómiai geometriájában rejlő komplexitás, ami megnehezíti a hagyományos szövetmérnöki megközelítésekkel történő biomérnöki munkát, valamint 2) a porcszöveti szintű szerkezet egyszerűsége az érrendszer hiánya miatt.23,36 Emellett a nanoelektronikai mátrixok alulról felfelé történő összeállítása lehetővé teszi a funkcionális makroszintű elektronikus komponensek hierarchikus létrehozását. Konkrétan egy kondrocitákkal beoltott alginát-hidrogél mátrix 3D nyomtatását mutatjuk be egy elektromosan vezető ezüst nanorészecskékkel (AgNP) átitatott induktív tekercsantennával, amely szilikonra támasztott csiga alakú elektródákhoz csatlakozik. Az eredmény a funkcionális elektronikus komponensek háromdimenziós integrációja az emberi fül komplex és pontos anatómiai geometriájába (1. ábra).

A folyamat a következő lépésekből áll. Először a bionikus fül CAD-rajzát (1A. ábra) használják fel az anatómiai geometria és a különböző funkcionális anyagok térbeli heterogenitásának előírására. A fent leírtak szerint három anyag alkotja a bionikus fül három funkcionális alkotóelemét (szerkezeti, biológiai és elektronikus). Ezeket az anyagokat egy fecskendős extrudáláson alapuló Fab@Home 3D nyomtatóba (The NextFab Store, Albuquerque, NM) adagoljuk (1B. ábra). A kinyomtatott bioelektronikus hibrid fülkonstrukciót ezután in vitro tenyésztik, hogy lehetővé tegyék a porcszövet növekedését egy olyan kiborgfül kialakításához, amely képes érzékelni az elektromágneses jeleket a rádiófrekvenciás (RF) tartományban egy vételi antennaként működő induktív tekercs segítségével (1C. ábra).

A megközelítésünk bemutatásához a következőképpen nyomtattuk ki a bionikus fülkonstrukciót. Az állványzathoz egy alginát-hidrogél mátrixot vetettünk be előzetesen életképes kondrocitákkal ~60 millió sejt/ml sűrűségben (lásd az alátámasztó információkat). Az alginát mátrix háromdimenziósan stabil a tenyészetben, nem toxikus, elővetéssel és extrudálással kompatibilis, és megfelelő sejtbeviteli hordozó, mivel a térhálósodás a lerakódás előtt megkezdhető.37 A nyomtatáshoz használt kondrocitákat egy hónapos borjak ízületi porcából izoláltuk (Astarte Biologics, Redmond, WA). A nyomtatási pályák meghatározásához egy emberi fülkagyló sztereolitográfiás formátumú (STL) CAD-rajzát használták, amely egy integrált, cochlea alakú elektródákhoz csatlakoztatott körkörös tekercsantennát tartalmazott, a modell kontúr- és raszterkitöltési pályák rétegeire történő felszeletelésével. A térhálósítást az életképes kondrocitákkal előzetesen beültetett alginát-hidrogél mátrixban indítottuk el, amelyet ezután 3D nyomtatással együtt vezetőképes (AgNP-infundált) és nem vezető szilikonoldatokkal nyomtattunk (1. film). Ezzel a módszerrel együtt a bionikus szerv biológiai, elektronikus és szerkezeti összetevőit egyetlen folyamatban állították elő.

A 2A. ábra a 3D nyomtatott bionikus fület mutatja közvetlenül a nyomtatás után. Figyelemre méltóan megállapítható, hogy hűen reprodukálja a CAD-rajzot, az egyes anyagok pontos térbeliségében, ahogyan azt a terv diktálta. A nyomtatott fülkonstrukciót 10% vagy 20% magzati szarvasmarha szérumot (FBS) tartalmazó kondrocita tenyésztőközegbe merítettük, amelyet 1-2 naponta frissítettünk (lásd az alátámasztó információkat). A hibrid fül jó szerkezeti integritást és alakmegtartást mutatott a tenyésztés alatt (2B. ábra). Idővel a konstrukció fokozatosan átlátszatlanabbá vált; ez leginkább a négyhetes tenyésztés után volt látható, és durván összhangban van az extracelluláris mátrix (ECM) kialakulásával. A bionikus fül bruttó morfológiája 10 hét in vitro tenyésztés után a Támogató információkban látható.

Az életképességet közvetlenül a nyomtatási folyamat különböző szakaszai előtt és közben vizsgáltuk. A sejtek kezdeti életképességét a tenyésztés után Trypan-kék sejtkizáró teszttel (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) határoztuk meg, és 96,4 ± 1,7%-osnak találtuk (2C. ábra) (lásd az alátámasztó információkat). A kinyomtatott, sejtekkel beültetett alginát fülét LIVE/DEAD® Viability Assay-vel (Molecular Probes, Eugene, OR) is teszteltük, és 91,3 ± 3,9%-os sejtéletképességet mutatott, homogén kondrocita eloszlással. Ez az eredmény arra utal, hogy a nyomtatási folyamat, beleértve a sejtek kapszulázását és lerakódását, nem befolyásolja jelentősen a kondrociták életképességét.

Ez a megközelítés, amely az előre beültetett hidrogél mátrix nyomtatását alkalmazza, kiküszöböli a beültetés mélységének korlátozásával és a nem egyenletes beültetéssel kapcsolatos főbb problémákat az előre formázott 3D állványok beültetésének hagyományos módszereiben. A kondrociták bioabszorbeálható alginát mátrixba történő beültetése és 3D nyomtatással történő alakítása a sejteket a kívánt geometriára lokalizálja, lehetővé téve az új ECM termelését meghatározott helyeken, amikor tápláló közegben tenyésztik. A szövet kialakulásával a polimer állványzat újra felszívódik (2D ábra), így az új szövet megtartja annak a polimernek az alakját, amelybe a sejteket beültették. A biológiailag lebomló állványzat minden sejt számára jobb hozzáférést biztosít a tápanyagokhoz és hatékonyabb salakanyag-elvezetést.

A következőkben szövettani kiértékeléssel hasonlítottuk össze a bionikus fül neokartilázában lévő kondrociták morfológiáját a natív porcszövetével. A hematoxilin és eozin (H&E) festés a kondrociták egyenletes eloszlását mutatta ki a konstrukciókban (2E ábra) (lásd az alátámasztó információkat). A fülszövet szövettani vizsgálata Safranin O festéssel a proteoglikánok viszonylag egyenletes felhalmozódását jelezte a tenyésztett fülszövetben (2F ábra). Ezek a biokémiai adatok összhangban vannak az új porcok kialakulásával.38 Végül fluoreszcens méréseket végeztünk a 3D nyomtatott bionikus fülszövet életképességének megállapítására 10 hetes in vitro növekedési kultúra után fluoreszcein-diacetát (FDA) és propídium-jodid (PI) festéssel. A 2G. és 2H. ábrán a tekercsantennát borító szövet, illetve a szövetre merőlegesen áthaladó elektródával érintkező belső szövet látható. Mindkét esetben a növesztett porc kiváló morfológiát és szöveti szintű életképességet mutatott. Figyelemre méltó, hogy a szövetek abiotikus elektronikus anyagok jelenlétében történő tenyésztésének ez a megközelítése minimálisra csökkentheti a növesztett szövet immunválaszát.

Ezután jellemeztük a porc mechanikai tulajdonságait a növekedés különböző szakaszaiban, mivel az ECM fejlődése erősen korrelál a fejlődő szövet mechanikai tulajdonságaival.39 Először kiterjedt biokémiai és szövettani jellemzéseket végeztünk. A 10% és 20% FBS-t tartalmazó tenyészetekből 2, 4, 6, 8 és 10 hét múlva mintákat vettünk, és lefagyasztottuk őket a neocartilage DNS-tartalmának méréséhez és az ECM biokémiai értékeléséhez (lásd az alátámasztó információkat). Az ECM felhalmozódását a konstrukciókban az ECM két fontos összetevőjének mennyiségi meghatározásával értékeltük: 1) hidroxiprolin (HYP) mint a kollagéntartalom markere, és 2) szulfatált glikozaminoglikán (GAG) mint a proteoglikánok markere. A 10. hétre a HYP-tartalom 1,2 ± 0,1 μg/mg-ra, illetve 1,4 ± 0,2 μg/mg-ra nőtt a 10%, illetve 20% FBS-t tartalmazó kultúrák esetében (3A ábra). A GAG-tartalom megfelelő értékei a 10. héten 10,6 ± 0,6 μg/mg és 12,2 ± 1,0 μg/mg voltak (3B. ábra). A GAG- és HYP-tartalom ilyen mértékű növekedése azt jelzi, hogy a kondrociták élnek és metabolikusan aktívak a kultúrában.

A következőkben a húzó tulajdonságokat elemeztük a 3D nyomtatott kondrocita-alginát kutyacsont minták vizsgálatával a tenyésztés különböző pontjain, ahol a kutyacsontok a fülével azonos sejtsűrűséget és azonos tenyésztési körülményeket tartalmaztak (lásd az alátámasztó információkat). A mechanikai tulajdonságok értékelése azt mutatta, hogy a kutyacsontok Young-modulusa az idő múlásával 14,16 kPa értékről 111,46 kPa értékre nőtt a 10. héten (3C. ábra). Az alacsonyabb, 20 millió sejt/mL kondrocitasűrűségű kutyacsontokat is hasonló körülmények között vizsgáltuk, hogy megértsük a kezdeti kondrocitasűrűség hatását a növesztett szövet mechanikai tulajdonságaira. Ezek alacsonyabb, 73,26 kPa Young-modullal rendelkeztek a 10. héten. Ezután a 3D nyomtatott fülkagyló növesztett porcszövetének keménységét nanoindentációs mérésekkel jellemeztük. A behúzásokat a fülkagyló különböző anatómiai helyein végeztük (3D ábra). Amint az 1. táblázatban látható, ezek a keménységi értékek viszonylag egyenletesnek bizonyultak, 38,50 kPa és 46,80 kPa között mozogtak, ami megerősíti a nyomtatott fül szerkezeti integritását.40

A 3D nyomtatott bionikus fül továbbfejlesztett funkcionalitásának bemutatására egy sor elektromos jellemzést végeztünk. Először a tekercsantenna ellenállását mértük négypontos szondás mérésekkel, és megállapítottuk, hogy az függ a vezető AgNP-vel átitatott szilikon nyomtatásához használt térfogatáramlási sebességtől (lásd az alátámasztó információkat). Az optimális áramlási sebesség mellett a nyomtatott tekercs fajlagos ellenállása 1,31 × 10-6 Ω-m volt, ami csak két nagyságrenddel magasabb, mint a tiszta ezüsté (1,59 × 10-8 Ω-m). Ezután vezeték nélküli rádiófrekvenciás vételi kísérleteket végeztünk. Annak bizonyítására, hogy a bionikus fül képes a normál hallható jelfrekvenciákon (embernél 20 Hz és 20 kHz között) túli jelek vételére, a bionikus fül induktív tekercséből kiinduló cochlea alakú elektródákhoz külső csatlakozásokat alakítottunk ki (4A. ábra). A fület ezután 1 MHz és 5 GHz közötti frekvenciájú szinuszhullámoknak tettük ki. A tekercsantenna S21 (előremenő átviteli együttható) paraméterét hálózati analizátorral elemeztük, és megállapítottuk, hogy a jeleket ezen a kiterjesztett frekvenciaspektrumon keresztül továbbítja (4B. ábra).

A legfontosabb, hogy a CAD-terv módosításával a végleges szerv sokoldalú módosíthatóságának szemléltető példájaként kinyomtattunk egy kiegészítő bal fület az eredeti modell egyszerű tükrözésével (lásd az alátámasztó információkat). A sztereofonikus hang bal és jobb csatornáját ferritmaggal ellátott mágneses hurokantennákon keresztül juttattuk el a bal és jobb bionikus fülhöz (4C ábra). A bionikus fülek által fogadott jeleket a kettős cochlea alakú elektródák jelkimenetéről gyűjtöttük össze, és egy digitális oszcilloszkópba tápláltuk, majd egy hangszórón keresztül lejátszottuk a hallás és a vizuális megfigyelés céljából. A 4D. ábrán a jobb és a bal bionikus fül 1 ms időtartamú küldött és fogadott jeleinek kivonata látható, és megállapítható, hogy a hangjel kiválóan reprodukálja a hangjelet. Lényeges, hogy a bionikus fülek által fogadott jelből lejátszott zene (Beethoven “Für Elise”) jó hangminőséggel rendelkezett (2. film).

Összefoglalva, olyan dizájner “kiborg füleket” gyártottak, amelyek képesek elektromágneses jelek vételére a Hz-től GHz-ig terjedő széles frekvenciatartományban. Stratégiánk elvi bizonyítékot jelent az additív gyártási technikák sokoldalúságának összefonódására a nanorészecske-összeszerelési és szövetszerkesztési koncepciókkal. Az eredmény a jóhiszemű bionikus szervek létrehozása mind a forma, mind a funkció tekintetében, amint azt a szövettechnológiai összehasonlító mérések és az elektromos mérések igazolják. Az ilyen hibridek különböznek a mesterséges szövetektől vagy a síkbeli/hajlékony elektronikától, és egyedülálló módon lehetővé teszik az elektronika és a szövetek zökkenőmentes integrációját a “készen kapható” kiborgszervek létrehozásához. Végül, a 3D nyomtatás alkalmazása a nanoméretű funkcionális építőelemek más osztályaival, beleértve a félvezető, mágneses, plazmonikus és ferroelektromos nanorészecskéket, bővítheti a bionikus szövetek és szervek tervezésének lehetőségeit.